黄曲霉毒素生物脱毒法研究进展

王少军，于春娣，唐娟，程果，谢晓丽，杨庆利，*

（1.中华人民共和国青岛海关，山东青岛266001；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

黄曲霉毒素以其毒性、致癌性、致畸、致突变性著称，它是黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，其本质为二氢呋喃香豆素的衍生物，其致癌特性的来源是香豆素结构，毒性来源是二氢呋喃环结构。目前，根据黄曲霉毒素分子在紫外照射下荧光颜色的不同分为两类：发出蓝色荧光的B类（B1、B2）和发出绿色荧光的 G 类（G1、G2）[1]，此外，还包括一些相似的衍生物，如M1、M2。在黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）被世界卫生组织癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC） 列为人类第一类致癌物，被认为是最常见和最强的致癌物质[2]，其毒性是亚硝胺的75倍、砒霜的68倍、氰化钾的10倍[3]。人类误食含有黄曲霉毒素的食物可导致黄曲霉毒素急性中毒[4]，并且导致肝脏受到损害，甚至引发肝癌[5]。家畜食用黄曲霉毒素污染的饲料可导致饲料采食量、生产性能和免疫功能的降低[6]。

黄曲霉毒素的产生受外界环境因素的影响较大，如在适宜的温度范围内（12℃～41℃），湿度越大、水分含量越高，黄曲霉毒素的产生越多；降低氧气的浓度、提高二氧化碳的浓度，黄曲霉毒素的生成量增加；此外，pH值和光照也会影响黄曲霉毒素的产生[7]。由于黄曲霉毒素广泛存在于环境当中，近年来对粮食作物和饲料的污染越来越严重。王君等[8]采集了8个省份市售玉米、花生、大米、核桃、松子等284个样品，经检测：玉米中黄曲霉毒素的检出率为70.27%，平均含量为36.51 μg/kg，最高为 1 098.36 μg/kg，其中 14.86%的玉米样品中黄曲霉毒素B1含量超出国家限量标准；花生中黄曲霉毒素检出率为24.24%，平均含量为80.27 μg/kg，最高为 437.09 μg/kg，其中 3.03%的花生样品中黄曲霉毒素超出国家及国际食品法典限量标准；大米、核桃、松子污染较轻，未超出国家限量标准。杨晓倩等[9]对2016年采集的山东省9市90份市售鲜玉米样品采用超高效液相色谱检测15种真菌毒素，其中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2检出率分别为 8.88%（8/90）、4.44%（4/90）、2.22%（2/90）和 1.11%（1/90）。徐进栋等[10]调查了2016年山东省各地规模化动物养殖场、各大饲料厂及养殖户的1 037份饲料样品中黄曲霉毒素B1污染状况，结果发现饲料中的玉米、花生饼粕、干酒糟及其可溶物（distillers dried grains with solubles，DDGS）和玉米胚芽粕4种原料的黄曲霉毒素B1含量均超标，超标率分别为27.71%、23.27%、6.90%和4.92%。

黄曲霉毒素在粮食、饲料中污染严重，对人类和家畜的健康威胁极大，怎样去除黄曲霉毒素成为当前科学家们研究的热点。目前，对于黄曲霉毒素的脱毒方法主要有物理法、化学法和生物脱毒法。物理法主要采取加热、辐照、溶剂萃取和吸附剂吸附等方法[11-14]。物理法去除黄曲霉毒素，去毒效果虽然好，但是脱毒不彻底，还存在一系列的问题，例如溶剂使用量大可能造成环境污染，引起操作人员中毒；可能改变物质原来的性质；吸附剂在吸附黄曲霉毒素的同时吸附了营养物质，降低了样品的营养价值[15]等。化学方法主要采用碱处理法和氧化法（臭氧、过氧化氢处理）等[16-17]。化学法虽然脱毒效果良好，但是极易产生副产物，而且化学处理剂难以完全去除，可能造成食品的二次污染。生物脱毒法较物理、化学等方法具有安全系数高、特异性强、绿色清洁等独特优势，被视为最具发展前景和潜力的脱毒方法[18]，但是目前生物脱毒法去除黄曲霉毒素的技术还没有广泛应用于工业化生产。本文综述了国内外黄曲霉毒素的生物脱毒法，为黄曲霉毒素生物脱毒的深入研究提供参考。

1 黄曲霉毒素生物脱毒方法

生物脱毒方法由于具有安全、高效、不可逆等因素存在巨大的应用和发展潜力。生物脱毒法包括生物吸附法、生物酶解法、生物提取物抑制法[19]。目前，对于黄曲霉毒素的生物降解，大多数的研究集中在生物吸附剂的发掘，降解黄曲霉毒素的微生物的筛选和分离，对黄曲霉及其产毒性能具有抑制作用的活性成分的分离提取上。近年来，菌类提取物以及植物提取活性成分对黄曲霉毒素的降解及抑制的研究逐渐发展起来。

1.1 生物吸附法

生物吸附法是通过生物体（主要是酵母菌和益生菌等）吸附黄曲霉毒素，这些生物体与黄曲霉毒素结合后形成复合物，从而达到去除黄曲霉毒素的目的。目前对于吸附黄曲霉毒素的微生物，国内外科学家研究最多的是酵母菌和乳酸菌，它们通过非共价方式与黄曲霉毒素结合形成复合物，黏附在细胞壁上，这种复合物状态稳定，难以被机体吸收，大部分被排出体外[20]。钱潘攀等[21]用麝香草酚裂解酵母细胞获得的细胞壁物质吸附黄曲霉毒素B1，结果发现：细胞壁提取物对黄曲霉毒素的吸附能力达到2.5 μg/mg。Shetty等[22]从西非国家加纳本土食品Kenkey（玉米制成的面团）和高粱啤酒中分离出18株酵母菌，研究其对黄曲霉毒素的吸附作用，结果发现这些菌株能够吸附超过60%的黄曲霉毒素，而且大部分菌株能够吸附15%以上的黄曲霉毒素B1。Fazeli等[23]发现提取于伊朗传统面包和乳制品中的干酪乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌能够结合黄曲霉毒素B1，其中干酪乳杆菌与黄曲霉毒素B1的结合能力最强。Oluwafemi等[24]在最近的研究中发现从发酵玉米中分离出来的嗜酸乳杆菌，可以吸附黄曲霉毒素，在玉米粒中人为添加不同浓度的黄曲霉毒素后，随着添加浓度的增加，嗜酸乳杆菌和黄曲霉毒素的结合率从54%降到23%。张建梅等[25]研究发现在畜禽霉变饲料中添加生物脱霉剂能够促进黄曲霉毒素B1随粪便排出。微生物吸附黄曲霉毒素是一种物理吸附，吸附力较弱，毒素只是吸附在微生物表面形成毒素-微生物复合物，毒素吸附不完全，吸附过程可逆，当复合物进入动物体内时有可能重新释放出毒素，因此生物吸附黄曲霉毒素具有一定的局限性。

1.2 生物酶解法

因为生物吸附法不能从根本上彻底去除黄曲霉毒素，生物酶降解黄曲霉毒素成为近年来研究的热点。生物酶解法是利用生物酶制剂催化降解黄曲霉毒素的一种方法，通过破坏黄曲霉毒素的毒性基团，将黄曲霉毒素降解为低毒或是无毒物质被生物利用或是排除体外，达到去除黄曲霉毒素的目的。生物酶解法主要分为真菌降解和细菌降解两大类，其作用特点是具有特异性、高效性，反应条件温和，反应过程不可逆。通过生物降解作用，将黄曲霉毒素降解转化成低毒或是无毒物质。目前已经发现许多细菌、真菌及其代谢产生的酶[26]能够降解黄曲霉毒素，其中能降解黄曲霉毒素的细菌包括分枝杆菌[27]、橙色黄杆菌[28]、红串红球菌[29]、嗜麦芽寡养单胞菌[30]、弯曲乳酸杆菌[31]、沃氏葡萄球菌[32]、枯草芽孢杆菌[33]等，能降解黄曲霉毒素的真菌有黑曲霉、茎点霉、根霉菌等[34]。

早在二十世纪六十年代，科学家们就开始研究通过生物降解去除黄曲霉毒素，最早被确认可以降解黄曲霉毒素的细菌是黄杆菌[35]。Liang等[36]分离出一株新嗜麦芽寡养单胞菌菌株，能够降解85.7%的黄曲霉毒素B1。Samuel等[37]发现恶臭假单胞菌能够很高效率的降解黄曲霉毒素B1，24小时混合培养后，培养基中不能检测出黄曲霉毒素B1。Adebo等[38]分离出的梭状芽孢杆菌培养48小时后能降解61.3%的黄曲霉毒素B1，培养60小时后黄曲霉毒素B1全部降解。王宁等[39]对具有降解黄曲霉毒素B1活性的黏细菌的产酶条件进行了优化，通过优化培养基成分和发酵条件后，该菌株降解黄曲霉毒素B1的能力提高到78.2%。李冰等[40]从300株细菌、真菌和放线菌中筛选出3株具有降解AFB1能力的菌株，包括一株乳酸菌、一株米曲霉和一株黑曲霉，其中黑曲霉降解能力最佳，降解率达93.28%，其降解活性主要来自黑曲霉胞外的代谢产物，从而得出黑曲霉对黄曲霉毒素B1的降解为酶促生化反应过程。Hackbart等[41]发现里氏木霉和稻根霉在PDA培养基中30℃培养5天后能够降解100%的黄曲霉毒素B1，但是没有试验证明在食品基质中存在这两种霉菌。Zeinvand-Lorestani等[42]发现漆酶（活力30 U/mL）在含有20%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中，35℃、pH值4.5，酶解反应两天后，能够去除67%的黄曲霉毒素B1。王勇[43]将黄曲霉毒素降解酶添加到肉仔鸡的基础日粮中，黄曲霉毒素降解酶可改善AFB1对肉仔鸡生长性能和肝脏酶活的影响，基本消除AFB1毒性。温思霞等[44]通过克隆表达得到假蜜环菌的黄曲霉毒素氧化酶，该酶的比活力为234U/mg，具有较好的黄曲霉毒素B1转化活性。目前对于生物酶降解黄曲霉毒素方面的研究还主要集中在菌株的筛选、产酶条件的优化上。对于酶分子的结构的剖析、作用机制的研究仍处于初步发展阶段。

1.3 生物提取物抑制法

继吸附法、酶解法后，研究人员发现从微生物或植物体内提取的某些活性成分，对黄曲霉具有抑制作用或能够降解黄曲霉毒素，这些方法统称为生物提取物抑制法。Reverberi等[45]研究发现从香菇中提取的多糖物质对寄生曲霉产黄曲霉毒素具有抑制作用。Zjalic等[46]研究发现来自于白腐菌的β-葡聚糖也能够抑制黄曲霉毒素的合成。李红波等[47]研究了香菇多糖、海带多糖、石耳素、燕麦β-葡聚糖等十余种不同结构的多糖对黄曲霉菌的生产和产毒的影响，其中海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素、香菇多糖能够明显降低黄曲霉菌丝产毒能力。上述多糖主要是β-葡聚糖通过激活了转录因子hsf-2，从而延迟产生黄曲霉毒素的相关基因的表达，以此抑制黄曲霉的产毒。除多糖外，一些植物水提物对黄曲霉及其产毒性能也具有抑制作用。吴清华[48]研究了茶叶中抑制黄曲霉毒素产生的组分，其中没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素、香豆素对黄曲霉产毒抑制较强，槲皮素的抑制强度最强。王淼焱等[49]研究发现槲皮素是通过激活抗氧化系统转录因子Yap1，导致黄曲霉体内的抗氧化酶系统活性的增加，从而抑制产生黄曲霉毒素基因的表达。李浩等[50]研究了云南大叶种晒青毛茶提取物对黄曲霉产毒的影响，结果表明云南大叶种茶能有效抑制黄曲霉AS3.4408产AFB1和AFB2，AS3.4408在云南大叶种茶中可能产生了黄曲霉毒素的前体物质，但茶叶中的某种物质抑制了合成该毒素的关键酶。此外，其他植物提取物也对黄曲霉的生长及产毒具有抑制作用，如梁丹丹等[51]研究发现植物提取物肉桂醛、柠檬醛和丁香酚对黄曲霉生长及产毒均具有抑制作用。许多研究发现许多中药提取物中含有多种活性物质可用于黄曲霉毒素的解毒，如郑海平[52]研究发现，银杏叶提取物对黄曲霉毒素B1致大鼠肝癌具有抑制作用，其主要是通过调节基因的表达阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡来发挥作用。张学梅[53]对黄芩提取物及其黄酮类化合物的研究发现，其能够通过抑制细胞色素P450的活性，从而阻止黄曲霉毒素转化成高致癌物质的过程，从而保护生物机体。张馨如等[54]研究了中草药提取物作为饲料添加剂的效果，各中草药提取物对黄曲霉具有抑制作用，用作饲料的防霉剂效果良好，使用含有中草药提取物的饲料的猪的血清抗氧化性能增强，其中公丁香提取物的效果最佳。此外，油茶籽及其饼粕[55]、半枝莲提取物[56]等对黄曲霉及其毒素的产生也具有抑制作用。

植物提取物中虽然含有多种抑制黄曲霉生长及产毒的活性物质，但由于黄曲霉分布广泛，环境中的黄曲霉毒素未进入生物体前不会产生任何危害作用，清除环境中所有的黄曲霉也是不切实际的，尽管近年来国家和社会各界对黄曲霉污染越来越重视，并且加大了市场的监管力度，但是，黄曲霉毒素还是会进入人类饮食和家畜的饲料中，而且丢弃轻度黄曲霉毒素污染的饲料会造成资源的浪费，近年来的研究逐渐转向增强生物体对黄曲霉毒素的解毒方向转变。

2 总结和展望

黄曲霉毒素是目前已知的霉菌毒素中毒性最强的一种，具有很强的致癌、致突变和致畸作用。近年来，因黄曲霉毒素严重污染粮食和饲料，对人类及动物健康造成严重危害，对于黄曲霉毒素的脱毒方法研究已成为各国科研工作者的一个热点。相对于物理、化学等黄曲霉毒素脱毒方法，生物脱毒法具有安全系数高、特异性强、绿色清洁等优势，是最具发展前景和潜力的脱毒方法。虽然生物脱除黄曲霉毒素是一种安全而又高效的方式，但目前大多数的研究均集中在生物吸附剂的发掘、降解黄曲霉毒素的微生物的筛选和分离以及对黄曲霉及其产毒性能具有抑制作用的活性成分的分离提取上，而对于活性成分降解黄曲霉毒素的结构、黄曲霉毒素降解后产物的安全性评价以及将实验室研究的理论向产业转型的问题研究较少。后期研究应将黄曲霉毒素的生物脱毒方法从实验室小规模的理论研究转型到大规模的产业化生产中，切实发挥出实际应用价值。