DNA提取方法及在古DNA中的应用

张杨　陈虹君　龙欢　杨开勇

摘 要：考古遗址留存下来的人类、动物遗骨遗骸和植物残留是古代生物信息的载体，为我们提供了重要的基因信息。文章概述了几种古DNA提取常用的方法及原理，并介绍了这些方法在古DNA研究中的一些应用实例。

关键词：考古；遗骸；古DNA；提取方法

我国墓葬、考古遗址中经常发掘出土大量猪、马、牛、羊等动物遗骨遗骸、古尸以及植物残留[1-6]，这些遗存为我们提供了古代动物、植物和人类重要的基因信息。古DNA是古代生物的信息载体，作为分子生物学研究的一个工具，在建立DNA动力学模型、探索环境改变与生物多样性的关系、详述灭绝动物的饮食、验证过去群落结构和基因流动障碍、表现生物两性的特性、推断古代和现代人类传播模式、澄清系统发育关系、阐明进化发育生物学等方面已经得到了广泛的应用[7-11]。古DNA对考古学、古生物学以及人类学科具有深远的影响，对于研究物种的起源与进化具有重要意义。文章阐述了几种提取古DNA的主要方法及原理，并列举了一些应用实例。

1 DNA提取的主要方法

1.1 Chelex-100法

原理：当检材比较少时或者基因分型仅需要少量的DNA时，可用Chelex-100提取方法来提取DNA。Chelex-100由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，是一种螯合树脂，含有亚氨基二乙酸盐离子，可以整合多价金属离子，且比一般的离子交换剂具有更强的金属离子选择性和较高的结合力，可螯合镁离子、钙离子等核酸必需的金属阳离子，防止DNA降解。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，且结合其他有可能会影响进一步分析的外源物质。经过离心，除去了Chelex-100颗粒，同时使得与DNA结合在Chelex-100上的物质分离，保证了下一步的PCR反应，DNA分析也不受抑制剂的干扰[12]。

方法：以血液DNA提取为例。取微量血液用约400μl纯水震荡破碎红细胞；13，000r/min离心去上清，收集沉淀；向沉淀中加入200μl5% Chelex-100溶液（使用前要充分振摇），在振荡器上反复振荡，放入56°C保温30min以上；取出后振荡混匀，100℃保温8min，振荡后，13，000r/min离心3min，上清用于PCR扩增，或放4°C保存备用。

应用：Chelex-100法适用于血迹、混合斑、毛根、尸骨等生物检材。整个提取过程只需在一个离心管里进行，大大减少实验中污染的可能性，且操作简便，耗时短，成本低廉。由于使用这种方法提取出来的DNA纯度不太高，且不适合长期保存，所以在实验室科研中该方法应用较少。

1.2 酚仿抽提法

原理：苯酚使蛋白质变性，且抑制DNase的降解，但是苯酚会微溶于水。氯仿不溶于水，且苯酚易溶于氯仿，所以可以有效去除苯酚，而且还可以萃取出其他脂类杂质。异戊醇可以减少蛋白质变性过程中产生气泡，而且还有助于不同溶质相的分离，使离心后上层含有DNA的水相、中间变形蛋白相及下层有机溶剂相保持稳定。所以一般酚仿抽提法首先用苯酚抽提，再用25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，最后为了彻底去除苯酚（苯酚对PCR扩增有强烈的抑制作用），采用24：1的氯仿-异戊醇抽提一次，然后用异丙醇或乙醇沉淀DNA。

方法：先用细胞裂解液和蛋白酶K消化样品，取上清，加入等体积Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温12000rpm/min离心10min，再取上清，加入等体积的25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温12000rpm/min离心10min，再取上清，加入等体积的24：1的氯仿-异戊醇，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温12000rpm/min离心10min，加入0.6～1倍体积异丙醇缓慢摇至沉淀出白色的DNA，4℃低温12000rpm/min离心5min，弃上清留下DNA沉淀，加入75%乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心去上清洗涤DNA，最后离心取上清，留下DNA沉淀，空气中放置挥发干净乙醇，加入60～100?L水溶解DNA。

應用：苯酚氯仿法可以用来提取各种生物的各种组织细胞的DNA，是提取DNA最常用的方法，方法步骤虽然不一，但这种技术对于高质量DNA提取是十分有效的。但是在提取古DNA过程中，一些色素物质在沉淀DNA时会一起沉淀，这些物质一般都是PCR反应中DNA聚合酶的抑制剂，会影响之后的PCR扩增效率。而且实验过程中需反复萃取，每一步都有DNA的损失，要求实验样品有较高的DNA含量。另外，苯酚、氯仿是有机溶剂，对人体和环境影响较大。因此，现在古代生物样品的DNA提取通常不采用苯酚氯仿法。

1.3 碱裂解法

原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据染色体DNA与质粒DNA在变性和复性上的差异来达到分离它们的目的。在pH为12.6的强碱溶液里，染色体DNA的碱基之间的氢键会断裂，使DNA双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的碱基之间的大多数氢键也会断裂，但是超螺旋共价闭合环状的两条互补链是不会完全分离的[13]，当以pH为4.8的NaAc缓冲溶液去调节其pH到中性时，变性了的质粒DNA又会恢复变性之前的构型而保存在溶液中，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构，经过离心，染色体DNA及其他大分子物质一起被去除。

方法：收集菌液，加入溶菌液，摇动混匀，冰浴10min。加入SDS-NaOH溶液冰浴10min。加入pH4.8的NaAC溶液冰浴10min。4℃10000r/min离心10min，小心地把上层清液倒入到另一个新离心管中，加入预冷好的无水乙醇，再把离心管放置-20℃冰箱中1h，沉淀析出DNA，离心10min，丢弃上清液，加入无菌水或TE缓冲液溶解DNA。

应用：碱裂解法主要用于菌液、动物毛发等样品的DNA快速提取，其优点在于简单、快速，价格低廉，不需大型仪器设备。但是不足之处是十分明显的：一是pH值调节不准确会导致随后的PCR扩增经常失败，二是提取的DNA中包含大量的蛋白质，纯度不高，不适合做Southern或其他对DNA质量要求高的实验。

1.4 二氧化硅（硅粒）法

原理：当溶液中的pH值低于或等于二氧化硅表面pKa值时，二氧化硅表面携带的负电荷就会减少，与DNA分子带的负电荷之间的排斥力也随之减小，会形成很多的水合离子，降低了DNA分子的水合程度，DNA分子从而集聚到二氧化硅的表面上。另外，细胞裂解剂干扰了双链DNA分子之间氢键的形成，从而产生了单链DNA分子，DNA单链分子与二氧化硅表面形成氢键，这种氢键力远高于DNA分子与二氧化硅表面的静电排斥力。先用洗涤液洗掉吸附有DNA分子的二氧化硅表面的其他杂质，再用pH值高于pKa的溶液洗脱吸附在二氧化硅表面上的DNA分子[13]。

方法：采用Rohland N[14]的方法步骤。

应用：二氧化硅法是基于常用于提取古DNA的硅粒法的基础之上而改进的，传统的硅粒法在提取DNA时仅仅使用了高浓度的异硫氰酸胍来裂解骨粉，这对骨粉只进行了有限的裂解，DNA并没有完全的释放出来[15]。本文采取的方法里的提取溶液含有EDTA和蛋白酶K，EDTA的作用是脱钙，蛋白酶K的作用是消化组织和包围了DNA的蛋白质，两者结合使用，可以使骨粉得到更好的裂解，充分释放出DNA。此方法简单、经济，可有效去除PCR抑制物，且提取的DNA纯度高，适合实验室常规、大规模使用，可提取年限久远的骨骼DNA。

1.5 试剂盒法

原理：试剂盒法中含有吸附材料，可以特异性地吸附DNA，过滤RNA及蛋白质等杂质，市场上主要有硅离心试剂盒，磁珠法试剂盒等。

方法：每种试剂盒的操作步骤见各种试剂盒的说明书。

应用：试剂盒法操作简单、规范，是提取和纯化DNA的比较简便的方法，硅离心柱试剂盒在市场上比较普遍，成本低，在提取古DNA研究中比较常用。磁珠法试剂盒提取纯化DNA有着更好的效果，在提取古DNA实验中有着明显的优势，但是成本较高[16]。

2 DNA提取方法在古DNA研究中的应用案例

Faerman[17]等在提取古骨头DNA鉴定性别时，使用了蛋白酶K消化，酚-仿抽提和Chelex纯化相结合的方法，发现使用Chelex纯化的DNA比不使用Chelex纯化的DNA得到了更好的PCR结果，并且在该实验中，Chelex的纯化效果比其他方法好，可以适用于很少样本量（少于1mg）的样本。Tracqui和Ludes[18]在提取古人类骨头DNA实验中使用了酚-仿抽提法提取DNA，再用CleanMix purification kit纯化DNA，所得的DNA在后续的PCR扩增等步骤中进行顺利。Maria de Lourdes Mu?oz[19]等人利用3种方法提取前西班牙人（距今200～1500年）的骨头及组织的DNA，并进行PCR扩增和测序，发现第1种方法最好。第1种方法：使用提取溶液（0.01M Tris-HCl，0.1 M EDTA and 0.2% SDS pH 8.0）和蛋白酶K消化及温育后，再用酚-仿抽提法提取，接下来用Amicon? Ultra-0.5 30 kDa columns浓缩。第2种：使用提取溶液（0.01 M Tris-HCl， 0.5 M EDTA pH 8.0），温育后再使用结合溶液（5M GuSCN， 0.025 M NaCl， 0.010 M Tris-HCl pH 8.0），然后QIAquick （Qiagen） silica column过滤，最后用TE缓冲液洗脱。第3种：苯酚-氯仿异戊醇（24∶4∶1）提取的DNA与5% Chelex-100在94℃煮10分钟，再离心。郭丽萍[20]等在研究明代古尸时使用了经典的酚-仿抽提法和Chelex-100法提取肌肉DNA，并用QiAquick PCR Purification Kit （Qiagen）纯化，得到了较好的结果。

Calvignac[21]等对古熊类样本进行DNA提取时，先用蛋白酶K和提取溶液进行抽提，然后用苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）洗三次上清液，再用Centricon 30 column浓缩DNA并用超纯水洗脱，最后用QIAquick kit （QIAGEN）纯化。H?ss和P??bo[22]在提取25000年前的马属动物的DNA时使用了硅粒法，并将它鉴定为野驴。Rohland和Hofreiter[23]用更新世时期洞熊的骨头和牙齿样本试验了Silica，Centricon，Phenol/chloroform，DNeasy tissue kit，DNeasy tissue kit，DNA IQ system這6种方法，发现silica方法效果最好，同时对silica方法进行了优化。Dabney[24]等在研究更新世中期洞熊时用Rohland和Hofreiter的方法提取了35bp～150bp一系列的DNA片段，发现随着DNA片段从150bp减少到35bp，提取效率也从75%降到25%。对此，他们改进了该方法，使之在提取35bp的DNA片段时达到提取150bp的效率。Cole[25]等报道了新西兰古DNA的研究进展，包括几维鸟、查塔姆岛鸭和哈斯特鹰等生物，以及骨头、毛发、博物馆样品中提取出的古DNA，成功揭露了新西兰不同生物的进化史和系统进化树。

Wood等[26]对新西兰北部图比多湾海岸线共济会酒馆考古遗址发现的距今750年左右的狗粪便化石分析时，一方面用EDTA、SDS和蛋白酶K溶液消化样品，取上清液，再用Dneasy Blood & Tissue Kit （Qiagen， Valencia， CA， USA）提取DNA并进行PCR实验分析，另一方面用氢氧化钾和盐酸对化石样品预处理，再用显微镜对上浮液分析，结果表明了粪化石来自于欧洲人还未迁移到新西兰之前的狗，并揭示了这些狗的饮食习惯。

蔡大伟等[27]使用了基于硅粒法和硅离心柱法的4种方法（方法A ：Modified Silica Particles Method；方法B：Ceneclean Method ；方法 C ：QIA amp Method；方法 D：Modified QIA quick method）提取5个距今约4000年的线粒体DNA，之后进行PCR扩增，发现基于硅离心柱方法的PCR成功率明显优于基于硅粒法的方法，Modified QIA quick method的效果最好。Levison等[28]用磁珠法从1.5mL的大肠杆菌JM109细胞培养中提取到了8.2?g的高质量的DNA，从每100?L的大马哈鱼精子水溶里提取到了至少14?L的DNA。樊龙江[29]对该方法稍作改进后，提取古稻样品的DNA，并用植物界保守通用引物和水稻分子标记SSR引物对DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶检测，获得了清晰的目标条带。

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