基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

陈磊，陈晟，吴敬，吴丹

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122

2 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

β-淀粉酶 (β-amylase，EC 3.2.1.2)，又称淀粉β-1,4-麦芽糖苷酶，是一种外切型淀粉酶，能够从淀粉的非还原末端依次水解相隔的 α-1,4-葡萄糖苷键生成麦芽糖。在大麦、甘薯、玉米、小麦和大豆等高等植物中都有着较丰富的 β-淀粉酶，其在酿造行业及食品工业中有很大的应用价值。例如，啤酒酿造行业利用麦芽中的 β-淀粉酶直接糖化，白酒工业中用作糖化剂；在食品工业中主要用于生产高麦芽糖浆、麦芽糖醇和饴糖等。自 1974年Higashihara等[1]首次发现了巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium胞外含有β-淀粉酶以来，又陆续发现其他几种能产生该酶的微生物，包括蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus[2-3]、环状芽孢杆菌Bacillus circulans[4]、多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa[5]、热厌氧杆菌属Thermoanaerobacterium和高温放线菌Thermeoactinomycessp.[6]等。

由于植物来源的β-淀粉酶提取、纯化过程较为复杂，成本较贵，相比而言微生物来源的β-淀粉酶具有生产操作简单、适合大规模工业化生产的优点。但是现已报道的微生物来源的β-淀粉酶大多耐热性差，且比酶活不高，不利于其工业化应用。因此筛选出高热稳定性的微生物β-淀粉酶对其在淀粉糖工业中的应用有着十分重要的意义。

易错PCR属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制来为酶基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造，并定向筛选研究进化酶的酶学性质。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。

目前国内外多数专家学者使用体外分子进化技术研究了多种酶制剂[7]，诸如脂肪酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，其酶学性质都得到了一定的改善。对于微生物来源β-淀粉酶的研究，目前主要是围绕不同宿主的克隆表达、酶学定性[8]，而针对其酶学性质的分子改造显得较少，在定向进化提高其热稳定性方面，尚未见相关文献报道。β-淀粉酶作为一种重要的工业用酶，广泛应用于淀粉糖、食品及医药等生产领域。例如，与麦芽糖淀粉酶、普鲁兰酶等复配制备超高纯度麦芽糖浆，生产高附加值的海藻糖、麦芽酮糖等。然而其热稳定性差，不利于酶的复配转化，具有容易染菌、反应液粘度高等缺点。本研究通过易错PCR技术对比酶活较高的弯曲芽孢杆菌来源的β-淀粉酶进行体外分子定向进化，通过LB琼脂淀粉板初筛、96孔板DNS法测酶活等方法，高通量筛选热稳定性提高的突变体，以期为其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Escherichia coliJM109、E.coliBL21(DE3)由本实验室保存；载体pET-24a(+) 和pMD18-T 购于大连宝生物公司。野生型 β-淀粉酶基因来源Bacillus flexusCCTCC 2015368 (bfa)，现已保存在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)。

1.1.2 培养基

LB液体培养基：酵母粉 5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB固体培养基：在LB液体培养基的基础配方上，添加1.0%–2.0% (W/V)的琼脂。

TB培养基：酵母粉24.0 g/L，甘油5.0 g/L，胰蛋白胨 12.0 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，KH2PO42.31 g/L。

SOB培养基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，MgCl20.952 g/L，NaCl 0.5 g/L，KCl 0.186 g/L。

LB琼脂淀粉板：在LB液体培养基的基础上添加可溶性淀粉1 g/L，用于突变体的初步筛选。

1.1.3 试剂

rTaq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Primer StarTMHS DNA聚合酶、DL-2000和DL-10000 DNA Marker均购于TaKaRa有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR纯化试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；中分子量标准蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司 (上海)；卡那霉素 (Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)均购自上海生工生物工程有限公司；分子级的胰蛋白胨和酵母粉购自英国Oxoid公司；所有质粒测序均由上海睿迪生物技术有限公司提供支持；无特殊说明，其他试剂均属于国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 突变体文库的构建和易错PCR技术

来源于Bacillus flexusCCTCC 2015368 (bfa)的β-淀粉酶基因用作构建突变体文库的模板，并设计上游引物ATTATT、CGTATACGTTG-3′)，并分别引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点 (下划线部分)。最适反应缓冲体系 (50 µL) 为：2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L MnCl2，0.2 mmol/L dNTPs，DNA模板为50 ng，5 µL 10×缓冲液Mg2+(-) 和rTaqDNA聚合酶为5 U，再加入ddH2O补足至50 µL。PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，并于4 ℃下保温。

将PCR产物用1% (W/V) 的琼脂糖凝胶电泳验证，用PCR纯化试剂盒进行胶回收。纯化后的bfa基因和载体 pMD-18T连接转化大肠杆菌JM109感受态细胞。用NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶消化质粒bfa-pMD-18T，获得易错bfa基因，然后连接到载体 pET24a(+)，得到的质粒命名为pET-bfa。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 表达宿主中，涂布于LB抗性平板 (Kan，30 µg/mL)，构建突变体文库。

1.2.2 突变体文库的筛选

使用高通量筛选平台 (Molecular Devices，Qpix 2) 从LB抗性平板 (Kan) 上挑选易错突变体BFA，将单克隆一一对应地接种到含有 600 µL新鲜LB培养基 (Kan，30 µg/mL) 的96深孔板中。重组菌在37 ℃、900 r/min下恒温振荡摇床中培养8–10 h，相同条件下转接50 µL种子培养基到含有600 µL新鲜TB培养基的96孔板中培养2 h，然后加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG诱导表达重组酶[9]。重组菌在25 ℃下诱导表达48 h后，将发酵液在4 000 r/min、4 ℃下离心20 min，取上清200 µL于96浅孔板中，这些96浅孔板中的酶液将用于初筛的酶活分析。本研究设计了一个LB琼脂淀粉板用于突变体BFA的初筛分析，通过使用高通量筛选系统的gridding程序，将突变体BFA的发酵上清一一转接到琼脂淀粉板并于 37 ℃下过夜培养。随后用碘液0.03% (W/V) 涂布琼脂淀粉板，发现有 β-淀粉酶活力的地方会产生透明圈，初筛的标准是根据透明圈的大小来判断的。选择突变体BFA酶活高于或等于野生型的，然后接种于96深孔板进一步筛选。最后通过96-孔板DNS法定量测定突变体BFA的酶活，选择出酶活大于或者等于野生型的突变体用于复筛分析。

1.2.3 野生型和突变体 β-淀粉酶的诱导表达和分离纯化

将带有重组质粒pET-bfa的大肠杆菌在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养 LB种子 (Kan，30 µg/mL) 8–10 h，然后吸取种子培养基2.5 mL接种到50 mL的TB发酵培养基中。在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养2 h后加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG，最后转移摇瓶至25 ℃、200 r/min继续培养48 h[10]。发酵液于8 000 r/min、4 ℃下离心20 min收集上清液。向上清液中加入研磨之后的硫酸铵至终浓度为45% (W/V)，混合物于4 ℃下过夜培养并用磁力搅拌器不断搅拌，确保沉淀完全。然后将混合物在4 ℃、8 000 r/min离心20 min收集沉淀，并用20 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 (pH 6.5) 悬浮，过夜透析。样品加载到用20 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡的SuperdexTM200 10/300 GL凝胶柱上，在0.5 mL/min的流速下使用上述缓冲液进行洗脱、收集纯化样品。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，12%聚丙烯酰胺) 检测目的蛋白的纯度和分子量[11]。

1.2.4 酶活力的测定

β-淀粉酶活力分析是通过测定水解淀粉所释放的还原糖的量。反应体系的混合物包括：0.5 mL 2%(W/V) 的可溶性淀粉，0.4 mL 50 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 (pH 7.0)，并将酶液稀释成适宜的浓度添加至最后体积为1 mL。在55 ℃下反应10 min之后，向1 mL的混合体系加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 终止反应。混合物在沸水中煮沸5 min发生显色后立即于冰浴上冷却，然后补加去离子水至最后体积为 12 mL，最后在540 nm下检测上述溶液的吸光值；并以相同条件下缓冲液的测定作为空白对照。

上述条件下，每分钟生成1 µmol/L麦芽糖所需要的酶量定义为1个酶活单位 (U)。

1.2.5 野生型和突变体β-淀粉酶的动力学参数

在55 ℃、pH 7.0的条件下以不同浓度的可溶性淀粉作为底物 (1–30 mg/mL)，通过上述DNS法测定纯化后的野生型和突变体酶的动力学参数。使用 GraphPad Prism 6.0软件将获得的数据拟合到Michaelis-Menten方程，得出Km和kcat值。计算野生型和突变体的kcat/Km，并比较结果。

1.2.6 野生型和突变体 β-淀粉酶最适温度及热稳定性的分析

纯化后的酶液分别在不同的温度范围内(30–70 ℃) 测定β-淀粉酶活力，以最高的酶活力为 100%，从而确定出野生型和突变体 β-淀粉酶的最适温度。

在 55 ℃下将纯化后的 β-淀粉酶保温在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 (pH 7.0) 中，于不同的时间范围内 (10–70 min) 分别取出样品并冰浴10 min，同时在不同温度下保温10 min，测定酶活力丧失50%时的温度，即酶的半失活温度T50。按照上述的DNS法测定残留酶活，并以未处理的酶活为100%，用作测定野生型和突变体β-淀粉酶的半衰期。

1.2.7 野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH分析

在pH 4.0–9.0的柠檬酸缓冲液中分别将两种酶稀释一定倍数，以上述分析的最适温度为条件测定β-淀粉酶酶活力，以最高的酶活力为100%，从而确定出野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH。

1.2.8 野生型和突变体的三维结构分析

使用 SWISS-MODEL数据 (http://www.expasy.org/swissmod/) 生成野生型和突变体BFA的三维结构模型，并且以同源性最高的蜡状芽孢杆菌β-淀粉酶 (1j10.1.A，PDB) 为模板[12-13]。借助 PyMol(http://www.pymol.org) 软件分析所有的蛋白质结构模型和图形特征。

2 结果与分析

2.1 突变体文库的筛选

重组菌E.coliBL21 (DE3)/ pET-bfa在大肠杆菌中表达、发酵，对野生型β-淀粉酶进行初始酶学性质研究。然后，以重组质粒为模板，通过设计引物进行易错PCR方法的高通量筛选，表达宿主为操作简单、方便的大肠杆菌。大约有6 000个转化子的突变体文库被用来筛选热稳定性提高的突变体 β-淀粉酶，阳性突变率估算为60%。β-淀粉酶水解活力的大小可以用透明圈定性分析，采用琼脂淀粉板显色初筛得到一部分透明圈比对照大的突变体[14]。

进一步将这些突变体于55 ℃保温40 min，并在 96-孔板和具塞试管中分别测定残留酶活。通过大量的实验结果和数据分析得出，初筛有时候获得透明圈比较大的突变体，经过复筛测酶活发现并不是很高甚至和对照差不多；但是，复筛得出热稳定性显著提高的突变体，后续摇瓶验证也会相应提高。经过一系列的初步研究验证，与野生型β-淀粉酶相比，有一株突变体的热稳定性显著提高。接下来把该突变体的质粒抽提出来送测序，测序结果分析出突变体BFA只发生了一个氨基酸的替换，将 476位天冬氨酸突变成了天冬酰胺(Asp476Asn)[15]。

2.2 野生型和突变体 β-淀粉酶的诱导表达和分离纯化

重组β-淀粉酶用0.05 mmol/L IPTG诱导表达于宿主E.coliBL21(DE3) 中，摇瓶发酵48 h之后收集酶液。为了进一步研究野生型和热稳定性提高突变体 β-淀粉酶的酶学性质，首先对重组酶进行(NH4)2SO4沉淀，透析脱盐初步纯化酶蛋白，然后通过柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 (20 mmol/L，pH 6.5)平衡的SuperdexTM200 10/300 GL凝胶柱浓缩、纯化 (表1和图1)，并使用Bradford法以牛血清蛋白为标准测定蛋白浓度[16]。从表2可知，突变体D476N的比活力为2 512 U/mg，比野生酶降低了18.76%。

2.3 野生型和突变体D476N的酶学性质分析

2.3.1 野生型和突变体β-淀粉酶的动力学参数

在 55 ℃下，使用不同浓度的可溶性淀粉为底物 (1–30 mg/mL)，分别测定野生型和突变体D476N的动力学参数 (表 2)。突变体 D476N的Km值为97.98 µmol/L，是野生型的1.14倍。突变体D476N的kcat值为2 273.12 s–1，比野生型下降了18.97%；突变体kcat/Km值减少为野生型的71.01%。

2.3.2 最适温度及温度稳定性

突变体 D476N和野生型 β-淀粉酶的最适温度和热稳定性见图2和图3。

从图2可以得知，野生型和突变体D476N β-淀粉酶的最适温度均为55 ℃；在30–55 ℃的温度范围内，β-淀粉酶的相对活力没有明显变化；值得注意的是，当温度升高到 60 ℃和 65 ℃时，突变体D476N能够保留最初酶活的75%和44%，而野生型仅保留其酶活的37%和23%。

表1 重组野生型和突变体β-淀粉酶的纯化过程参数Table 1 Parameters of purification step of the recombinant wild type and mutant β-amylase

图1 SDS-PAGE分析纯化后的野生型和突变体D476N β-淀粉酶(M：中分子量标准蛋白；1：野生型；2：突变体D476N)Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified wild type and mutant D476N β-amylases.M: marker; 1: wild type;2: mutant D476N.

表2 野生酶和热稳定性提高突变体 D476N的动力学参数Table 2 Kinetic parameters of wild type and mutant D476N enzymes

图2 野生型和突变体D476N的最适温度Fig.2 The optimum temperature of wild type and mutant D476N.

图3 野生型和突变体D476N的热稳定性Fig.3 The temperature stability of wild type and mutant D476N.

不同温度下保温10 min，测定酶活力丧失50%时的温度，即酶的半失活温度T50。实验结果表明，突变体D476N的半失活温度T50值为62 ℃，与野生型T50值58 ℃相比提高了4 ℃。在最适温度55 ℃的条件下，通过测定不同时间点残留酶活来确定突变体D476N的热稳定性[17-18]，并与野生型相比较(图3)。从图3可知，突变体D476N在55 ℃下的半衰期为35 min，而野生型的半衰期只有18 min。

2.3.3 最适pH

突变体D476N和野生型β-淀粉酶的最适pH见图4。

由图4可见，野生型的最适pH为7.0，突变体D476N的最适pH为6.5；在pH 5.5–8.0的范围内，β-淀粉酶的相对酶活力均能保持在70%以上。目前β-淀粉酶的工业化应用主要是和其他酸性淀粉酶进行复配使用，突变体D476N的最适pH比野生型降低了0.5个单位，提高了重组酶酸性耐受性，更加有利于酶的催化反应[19]。

3 讨论

图4 野生型和突变体D476N的最适pHFig.4 The optimum pH of wild type and mutant D476N.

本研究基于易错PCR技术的定向进化策略筛选热稳定性提高的突变体BFA，经过一系列的初筛、复筛最终获得了一株热稳定性提高的突变体D476N。突变体E.coliBL21(DE3)/pET-D476N表达在宿主E.coliBL21(DE3) 中，经过硫酸铵沉淀、浓缩、纯化[20]突变体重组β-淀粉酶；酶学性质和动力学参数测定发现，突变体 D476N与野生型相比对底物的亲和性无明显变化，而对可溶性淀粉的催化活性有少许降低。突变体 D476N在高温条件下能够保留较高的酶活，表明突变体 D476N的耐热性比野生型有明显提高[21-22]。

为了阐明突变体 D476N热稳定性提高的机理，对野生型和突变体D476N使用SWISSMODEL程序同源建模。以同源性最高的蜡状芽孢杆菌晶体结构为模板 (1j10.1A，PDB) 模拟得到野生型和突变体D476N的三维结构。最近有研究发现，蛋白质表面的 loop区域对蛋白质的稳定性有重要作用，如淀粉液化芽胞杆菌来源的突变体葡聚糖酶[23]，通过定向进化-易错 PCR筛选得到热稳定性显著提高的突变株，其共发生了7个氨基酸的取代，有5个位于蛋白质的loop区域。使用PyMol软件显示出生成的突变体D476N的结构模型和突变点的位置，发现突变后的氨基酸残基 Asn476也位于蛋白质的表面loop上 (图5)。

图5 热稳定性提高的突变体D476N β-淀粉酶的三维结构和突变氨基酸定位Fig.5 Three-dimensional structure of the mutant D476N β-amylase with increased thermostability and the location of mutated acid Asn476.The figure was made using PyMol.

MOE是一款基于分子动力学模拟和蛋白设计的软件，并能够计算蛋白质和小分子配体的能量，与小分子药物设计和蛋白质工程等领域紧密相关。本研究中，首先利用MOE软件将同源建模模拟得到的野生型和突变体D476N的三维PDB结构能量最小化，然后分别计算出野生型和突变体D476N的分子自由能[24](ΔG)，软件预测结果表明野生型β-淀粉酶和突变体 D476N 的分子自由能分别为118.20 kcal/mol和106.01 kcal/mol。根据蛋白质分子自由能 (ΔG) 和热稳定性呈负相关的关系，可以得知，野生型β-淀粉酶将476位的天冬氨酸替代为天冬酰胺后，导致β-淀粉酶的分子自由能由118.20降低为106.01 kcal/mol，下降了10.3%。这一结果为蛋白质热稳定性提高提供了有力的依据，同时也表明了蛋白质表面 loop区域的氨基酸突变对稳定性的影响起到了显著的作用。

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