血液循环miRNA在肺癌中作用的研究进展

陈君，徐孝飞

(1 解放军第一一七医院，浙江杭州 310000；2 杭州联科生物技术股份有限公司)

肺癌是发病率和病死率增长最快的癌症 ，如何精准诊断肺癌成为当前世界亟待解决的难题。液体活检在癌症中无创伤性早期诊断和实时监测的作用给癌症患者带来了希望。目前，液体活检能检测各种循环癌症生物标志物，如循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA、循环miRNA等。miRNAs是一类内源性非编码的RNA小分子，长度19～25个核苷酸。miRNA首先在核内被RNA聚合酶Ⅱ转录合成初级miRNA，再由Drosha-DGCR8加工形成60～100 nt茎环结构前体miRNA，然后被核运输受体exportin-5和核蛋白Ran-GTP运送至细胞质，由Dicer再进一步加工形成25 nt成熟miRNA[1]。miRNA可通过其靶基因调控下游细胞通路，影响细胞的增殖、转移、凋亡、耐药等[2]。循环miRNA可能来源于损伤的组织、凋亡坏死的细胞以及细胞中的微囊泡，它稳定存在于血清、血浆等体液中，在肿瘤疾病患者体内和正常人的表达存在显著的差异，因此循环miRNA可作为肿瘤预测的生物学标志物。目前，已有很多研究报道，miRNA在血液中检测可发挥疾病诊断、患者预后评估、治疗反馈的功能。

1 血液中循环miRNA的检测技术

在肺癌中，循环miRNA检测样品主要是血浆或血清，由于样品体积少，miRNA在血清或血浆中含量不高，后续选择适合的检测技术尤为重要。McDonald等[3]报道循环miRNA在血浆或血清中比较稳定，但由于红细胞内也存在大量miRNA，血液样品不及时处理会受到溶血影响，导致检测结果精确度不够，因此选择参照标准化时，采用外源添加的cel-miRNA-39-3p作为外参。另外，Guo等[4]专门比较了5种血清循环miRNA提取试剂盒(Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit，ThermoFisher Scientific Ambion TRIzol LS Reagent，Qiagen miRNEasy，QiaSymphony RNA extraction kit和Exiqon MiRCURY RNA Isolation Kit)提取小RNA的质量，Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit获取的miRNA变异性最佳，但Ambion TRIzol LS Reagent提取获得的miRNA阅读数百分比最高，各个提取试剂盒均有优劣。

检测循环miRNA的常规方法一般有两种，基因芯片表达谱和PCR检测。基因芯片表达谱检测用于高通量筛选差异miRNA，PCR检测则进一步验证选定的miRNA是否有效。经实验比较，对于血液中的miRNAs检测，基于Q-PCR平台的芯片(TaqMan ABI，miRCURY Exiqon)敏感性更高，而在血浆中低表达的miRNA，miRCURY的敏感性和准确性优于TaqMan平台[5]。PCR检测又细分为Q-PCR和ddPCR，但Q-PCR和ddPCR两种方法检测出来的肺癌循环miRNA结果并没有很大区别[6]。此外，Gao等[7]研发了一种利用硅钠米线场效应的生物传感器，可同时检测miRNA-126和癌胚抗原的表达水平。

2 循环miRNA在肺癌中的诊断价值

肺癌主要分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大基本类型，NSCLC又包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。目前，在各类肺癌中都有文献报道循环miRNA可作为诊断指标。

Shang等[8]发现 miR-22在鳞癌患者血浆中表达高于正常人，miR-126在腺癌患者血浆中表达低于正常人，并且这两个miRNA预测NSCLC发生的受试者工作特征曲线(ROC)中曲线下面积(AUC)均大于0.8，另外关于NSCLC转移的ROC中AUC均大于0.7。Wang等[9]选取118例早期肺癌患者，48例中晚期肺癌患者和135例健康人血清进行探针预测miRNA和Q-PCR验证，发现miR-125a-5p、miR-25和miR-126联合诊断较为准确，AUC在诊断早期肺癌时已达0.936。因此，多个miRNA作为生物标志物来诊断肺癌发生，灵敏度和特异度高于单个miRNA，有更好的诊断精确性。

miRNA还可以和某些基因或蛋白联合诊断肺癌发生。Roth等[10]通过35例NSCLC患者和7例良性肺部肿瘤患者以及28例正常人的血清比较，发现NSCLC患者血清中半胱天冬酶活性比正常人高,但又比良性肺部肿瘤患者低，还发现miR-10b、miR-141、miR-155在NSCLC患者血清中含量高于正常人和良性肺部肿瘤患者，AUC均大于0.7。

3 循环miRNA在肺癌中的预后评估价值

Wang等[11]使用全miRNA表达谱芯片测试长生存期(大于24月)NSCLC患者及短生存期(小于6月)患者，分析出140个高表达的miRNA，再通过生物信息学GO分析和miRNA靶基因预测数据库，筛选出与TGF-β1信号通路相关的35个miRNA，进一步用比例风险回归模型分析生存期影响因素，得出17个miRNA与2年生存期有明显关联。其中miR-16表达在长短生存期中差异最大，长生存期与高表达的miR-16有关。进行风险评分得出，高风险分数患者比低风险分数患者死亡率增加2.5倍，中位生存率减少7.8个月。

Rui等[12]根据SCLC能否安全接受放疗条件分组，挑选22例局限期(LD)SCLC和50例广泛期(ED)SCLC患者血清进行miRNA芯片分析。结果显示，miR-574-5p等4个miRNA在ED组中高于LD组，而miR-184和miR-4459则是LD组高于ED组。再进一步用45对相应的组织和血清进行验证，体外验证选用H446和H2227细胞，得出miR-184通过抑制EPAS1基因从而抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制SCLC转移侵袭，miR-574-5p抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促进SCLC转移侵袭。另有研究表明，miR-574-5p在A549、PC-9等NSCLC细胞中同样具有抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促进细胞迁移侵袭作用，但是miR-574-5p表达高低在75例患者无进展生存期(PFS)和总生存率(OS)上差异并没有统计学意义，并不是NSCLC预后因子[13]。SCLC和NSCLC中预后相关miRNA虽然可能具有同样的生物学功能，但临床上并不能通用。

4 循环miRNA在肺癌中的治疗反馈功能

在放疗方面，Sun等[14]通过80例Ⅱ～Ⅲ期接受放疗局部晚期NSCLC患者血清miRNA表达谱检测，筛选出11个miRNA预测放疗剂量增减对OS的影响，建立了一种剂量反馈评分(DRS)的算法，可有效预测高剂量和标准剂量治疗后患者的OS。低DRS的患者中，高剂量放疗与标准剂量放疗相比显著改善OS，且大剂量放疗也能降低远处转移和局部进展的风险。高DRS患者高剂量放射治疗和标准剂量放疗在OS上相似。

在化疗方面，Li等[15]从60例NSCLC患者和30例正常人的血清miRNA比较中发现,miR-210表达升高可作为NSCLC诊断依据，且根据36例接受2～3次铂类化疗的晚期NSCLC患者的疗效反馈分析，稳定和疾病进展组患者比局部缓解组患者血清miR-210表达更高。Shi等[16]重点关注ⅢB期和Ⅳ期肺腺癌患者(无EGFR基因和ALK基因突变)培美曲塞联合顺铂一线治疗后单用培美曲塞维持治疗情况，通过76例培美曲塞维持治疗组和72例只接受最佳支持治疗的观察组患者血清miRNA谱比较发现，高表达miR-145、低表达miR-25和miR-210的培美曲塞维持治疗人群具有较长的PFS。

在靶向药物方面，Shen等[17]通过60例表皮生长因子受体(EGFR)突变患者和68例EGFR未突变患者血清miRNA表达谱检测发现,miR-21可作为吉非替尼治疗反馈的预测因子，吉非替尼治疗后降低了miR-21表达，患者获得了更长的OS。此外，miR-10b在EGFR突变患者血清中含量高于未突变患者，且在进展期表达高于疾病完全缓解或疾病稳定期，但miR-10b表达与EGFR是否突变没有相关性。

程序性死亡受体1(PD-1)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)是最近癌症免疫治疗的热点，目前还未有循环miRNA在PD-1或PD-L1治疗前后的临床血液miRNA监测数据，但有文献表明，miR-200家族、miR-34NA家族和miR-197在肺癌NSCLC细胞中与PD-L1有一定相关性[18]。

5 展望

目前，关于一些miRNA在血液中各组分中是否有表达已有相关数据库(http://134.245.63.235/ikmb-tools/bloodmiRs)可查询，但这些miRNA仍不全面，未能获知miRNA在肺癌临床中发挥了何作用。因此，我们仍需进一步试验归纳，获得不同肺癌种类的最佳预测、预后、治疗反馈功能特殊miRNA，用来作为生物标志物，以达到精准治疗的目的。

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