细胞膜色谱技术应用于中药活性成分筛选的研究进展

徐 硕，姜文清，邝咏梅，徐文峰，金鹏飞

(北京医院药学部，国家老年医学中心，药物临床风险与个体化应用评价北京市重点实验室，北京 100730)

生物膜上存在多种活性蛋白，细胞通过膜上的受体和离子通道等信息靶点与其他细胞、组织进行信息传递、交流、分析、综合，维持机体内外环境的平衡，实现生命活动[1]。细胞膜上的受体、通道能选择性地识别药物中的化学成分并与之特异性结合，通过影响细胞内第2或第3信使分子导致一定的生物效应，最终产生药理作用[2]。

细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，CMC)是将活性组织细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相，以缓冲溶液为流动相，将药物添加在流动相中，利用色谱学技术研究药物与固定相之间作用规律的受体动力学新方法[3-4]。

CMC技术在中药活性成分的研究中具有优势，本文综述了CMC技术在中药活性成分筛选应用中的研究进展，以期为进一步发展该技术提供参考。

1 CMC的基本原理和特点

CMC与高效液相色谱(HPLC)、细胞生物学和受体药理学等内容相结合，运用药物与膜受体之间的特异性亲和力，将药物在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。研究药物与固定相上细胞膜和受体的相互作用，获得如容量因子k′和不对称因子As等色谱参数，可为阐明药物的作用机制、药物与受体亲和作用以及新药开发等方面提供参考[5-6]。

2 在中药活性成分筛选中的应用

近年来，CMC在中药活性成分筛选研究中的应用涉及到多个方面，见表1。

2.1抗炎镇痛活性成分的筛选 王建寰等[7]从老瓜头二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位分得4个化合物，正丁醇部位分得2个化合物，总生物碱中分得1个化合物。采用 SD 大鼠大脑皮层细胞制备细胞膜固定相，初筛了老瓜头的镇痛抗炎活性部位和活性成分，结果表明，华北白前醇、老瓜头总生物碱和7-脱甲氧基娃儿藤碱可较强结合SD大鼠大脑细胞膜上的受体或靶点，但其作用靶点和机制有待于进一步深入研究。

5-羟色胺(5-HT)受体在偏头痛发病中起重要作用。杜晖等[8]通过大鼠纹状体组织获得色谱固定相，运用细胞膜色谱结合液相色谱技术，特异性地识别川芎-白芷药对中可与固定相上受体相互作用的配体，发现欧前胡素是其潜在的活性成分。以不同浓度5-HT1D受体激动剂舒马普坦为模型药物，采用硝酸甘油致大鼠偏头痛模型对生物活性进行验证。

表1CMC技术应用于中药活性成分筛选的不同细胞膜类型

Tab.1 Application of CMC technique in different cell membrane types for screening bioactive components from traditional Chinese medicine

活性成分类型细胞膜类型中药抗炎镇痛大脑皮层细胞膜老瓜头[7]纹状体组织细胞膜川芎-白芷药对[8]抗心血管疾病CD40高表达细胞膜丹参[9]β1肾上腺素受体(β1-AR)细胞膜羌活[10]、夏天无[11]血管平滑肌细胞膜白芷、羌活、北沙参、蛇床子[12-13];五味子、南五味子[14];佛手[15];当归[16]心肌细胞膜川芎[17]、附子[18-19]抗糖尿病胰岛β细胞膜黄连[20]抗肿瘤人肝癌HepG2细胞膜苦参[21]人乳腺癌MDA-MB-231细胞膜厚朴[22]成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)细胞膜白芥子[23]红细胞膜金刷把[24]血管内皮生长因子受体(VEGFR-2)高表达细胞膜乌头[25]表皮生长因子受体(EGFR)高表达细胞膜马钱子[26]SMMC-7721细胞、HepG2细胞鸦胆子[27]成骨牙周韧带细胞膜黄连[28]抗过敏嗜碱性粒细胞性白血病RBL-2H3细胞膜胡椒[29]、红花[30]

2.2抗心血管疾病活性成分的筛选 林蓉等[9]对丹参中抗动脉粥样硬化的活性成分进行了筛选。通过建立CD40高表达的内皮细胞(ECV-304)，得到细胞膜固定相，即利用CD40高表达的内皮细胞膜色谱模型进行研究。结果表明，丹参脂溶性和水提取部位均与CD40高表达细胞膜具有亲和作用，从这2个部位中分得的丹参酮ⅡA、丹参酮ⅠA和丹参素为其活性成分。

心肌组织中主要分布β1-AR。在临床中,β1-AR受体阻滞剂是治疗心肌缺血、心肌梗死和慢性心脏衰竭等疾病的常用药物。Yue Y等[10]采用高表达β1-AR的中国仓鼠卵巢细胞 CHO-S，构建了CMC体系，筛选羌活中作用于β1-AR的活性成分，结果表明，异欧前胡素为其有效成分。王新等[11]建立了以β1肾上腺素受体(β1-AR)细胞膜色谱与UPLC-MS联用技术，筛选鉴别夏天无中的活性成分。采用美托洛尔和药根碱处理β1-AR/CHO-S 细胞24 h，换异丙肾上腺素损伤细胞10 h后，ELISA法测定活性成分对β1-AR下游因子cAMP和PKA水平的影响，评价其对β1-AR的抑制作用。结果表明，药根碱是夏天无中具有β1-AR抑制作用的活性成分，β1-AR/CMC-offline-HPLC/MS分析方法能够快速且有效筛选出作用靶点明确的活性成分，实验结果和生物效应具有一致性。

Hou X F等[12]将建立的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞CMC系统与离线GC-MS技术联合应用，研究了作用于L-型钙通道的活性成分。结果从白芷、羌活和北沙参中筛选得到欧前胡素，从蛇床子中筛得蛇床子素，蛇床子素是蛇床子中含量最高的一种羟基香豆素类有效成分[13]。

Yang X等[14]建立了来源于大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞膜色谱，结合HPLC-MS技术，对五味子和南五味子中具有血管扩张作用的成分进行筛选，结果表明，去氧五味子素和五味子酯甲是其活性成分。去氧五味子素能够竞争性拮抗硝苯地平与细胞膜受体的结合，去氧五味子素与五味子酯甲部分重叠VSM细胞膜的结合位点。体外实验表明，去氧五味子素和五味子酯甲对大鼠胸主动脉(先用氯化钾进行处理)具有扩张作用，且呈剂量依赖性。

王艳微等[15]采用大鼠血管平滑肌细胞膜色谱模型(VSM/CMC)筛选，LC-MS离线分析，结合离体药理实验确定佛手舒张血管的有效成分。结果显示，佛手柑内酯具有舒张血管作用。化合物在VSM/CMC的保留特性与其药理活性的相关性十分显著，说明化合物与细胞膜和膜蛋白之间的相互作用可通过VSM/CMC模型反映出来。

赵惠茹等[16]对当归中具有舒张主动脉血管作用的成分进行筛选。采用CMC筛选，TLC法分离，结合体外药理实验对活性成分进行确认。结果表明，化合物与细胞膜和膜蛋白之间的相互作用可通过血管CMC模型体现出来，化合物在CMC系统里的保留特性与其药理活性的相关性十分明显，当归具有血管舒张作用的有效部位是其乙醚提取物。

岳宣峰等[17]将家兔心肌细胞膜与硅胶载体进行固定，通过比对川芎水提液、醇提液与心肌细胞膜上已知受体的部分激动剂和拮抗剂在心肌细胞膜色谱柱中的保留特性，对川芎提取液和心肌细胞膜受体的相互作用进行探讨。结果表明，水提液和醇提液均能在心肌细胞膜色谱柱上得到保留，β1受体激动剂不影响水提液的保留特性，而这种特性受到α受体阻断剂竞争结合的影响。结果表明，与α受体作用的有效成分存在于川芎水提液中，而水提液中没有与β1受体作用的有效成分，与心肌细胞膜受体作用的成分也存在于醇提液中。

中医将附子用于“回阳救逆”，研究表明，去甲乌药碱是附子的强心成分[18]。曹岩等[19]通过CMC和HPLC-TOF/MS技术相结合，对附子中的活性成分进行初步筛选和鉴定。采用大鼠心肌细胞膜色谱柱，以10 mmol·L-1磷酸盐缓冲液为流动相，色谱分离采用C18柱，以1 mL·L-1甲酸水溶液-乙腈为流动相，利用质谱对化合物进行鉴定，结果显示，苯甲酰乌头胺和苯甲酰新乌头胺和苯甲酰次乌头胺等8种成分可能是附子中的活性成分。

2.3抗糖尿病活性成分的筛选 磺酰脲受体(SUR)分布于胰岛β细胞膜上，当SUR与磺酰脲药物相结合之后，可对胰岛素的释放产生促进作用。Tang C等[20]研究了黄连中作用于SUR的活性成分，通过CMC技术，将小鼠胰岛细胞和毛细管相结合，得到细胞膜毛细管色谱固定相，结果表明，筛选出的有效成分为小檗碱。

2.4抗肿瘤活性成分的筛选 Chen X等[21]对黄柏和苦参中的抗肿瘤活性成分进行研究，建立了HepG2细胞膜色谱模型，并与质谱技术联用，结果黄连素和延胡索乙素、苦参碱和氧化苦参碱分别从黄柏和苦参中被筛选出来。这4种成分类似于吉非替尼，能够作用于HepG2细胞膜上的表皮生长因子受体；通过体外实验证实：黄连素和延胡索乙素能够抑制HepG2 细胞的增殖，且这种作用呈浓度依赖性。

Hou X等[22]对厚朴中的抗乳腺癌活性成分进行筛选，MDA-MB-231细胞膜固定相的制备是以硅胶作为载体，与2D LC-MS技术联用，结果表明，和厚朴酚和木兰醇是其抗乳腺癌的有效成分。

肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和转移与成纤维细胞生长因子受体4(FGFR 4)以及FGFR 4信号通路的激活密切相关，可以根据这个特性筛选活性成分。Zhang T等[23]对白芥子中可作用于FGFR 4的化合物进行筛选。通过建立能够用于识别-筛选-鉴定与FGFR 4相结合成分的二维在线联用系统，考察FGFR 4/CMC-HPLC/MS体系的专属性、可靠性和重复性，最终筛选出芥子碱为白芥子中的有效成分。

张博等[24]运用柱色谱技术分离金刷把中的化学成分，通过兔红细胞膜色谱模型进行筛选，结合MTT比色法，筛选出具有抑制HeLa细胞生长作用的化合物。结果显示，乙醚萃取部位为具有细胞毒活性的有效部位，从中分得的化合物为活性成分。结果表明，该模型能使细胞毒性成分与细胞膜、膜受体之间的相互作用在分子水平上得以体现，显著的保留特性可通过色谱过程表现出来。

血管内皮生长因子受体(VEGFR-2)在卵巢癌和甲状腺癌等肿瘤中过度表达。Li M等[25]通过VEGFR高表达CMC结合HPLC-MS技术，对乌头中作用于VEGFR-2的有效成分进行筛选，结果表明，次乌头碱、乌头碱和海帕乌头碱为其中的活性成分。

表皮生长因子受体(EGFR)在多种人恶性肿瘤细胞中高表达。Sun M等[26]对马钱子中具有抗EGFR的活性成分进行筛选。EGFR高表达的HEK293细胞膜固定相是通过以硅胶为载体进行制备，与HPLC-MS技术联用，筛选出的主要有效成分为马钱子碱和士的宁。体外实验表明，马钱子碱和士的宁能使HEK293/EGFR细胞的增殖以及胞外信号调节激酶(Erk)的磷酸化得到明显抑制，对下游传导信号分子的表达也具有抑制作用。

纪松岗等[27]建立了SMMC-7721细胞-鸦胆子和HepG2细胞-鸦胆子的全二维细胞膜色谱-整体柱色谱的高通量活性成分筛选模型，用于筛选鸦胆子油的抗肿瘤活性成分。结果显示，腺苷和鸦胆子苦素B可能是其活性成分。

2.5成骨活性成分的筛选 Liu J等[28]通过牙周韧带细胞膜色谱，结合实时在线质谱技术，筛选出其潜在的成骨活性成分为黄连素。黄连素可作用于人牙周韧带细胞，对人牙周韧带细胞的生长具有促进作用，并能使细胞培养基中ALP 的分泌增加，促进矿化结节的形成。

2.6抗过敏活性成分的筛选 Ⅰ型超敏反应的发生需要免疫球蛋白E(IgE)的参与，与IgE高亲和力受体FcεRI 结合能导致肥大细胞脱颗粒并使炎性介质释放。Huang J等[29]研究了胡椒中作用于FcεRI受体的成分，CMC系统的构建是通过大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞RBL-2H3完成的，并联用HPLC-MS技术对筛选出的成分进行鉴定，结果表明，胡椒碱为其中作用于FcεRI受体的活性成分。Han S 等[30]利用相同的系统，筛选出红花中的抗过敏活性成分，结果显示，羟基红花黄色素A为其有效成分。

3 结语

中药具有非常复杂的化学成分，对其药效物质基础进行研究是目前科研工作者研究的热点问题之一。中药活性成分的筛选是阐明其药效物质基础及开发新药的重要工作。实现中药现代化研究迫切需要适合于中药复杂体系的新研究策略。应用CMC技术可较快地筛选出活性成分，结合制备型HPLC，对成分进行富集，在实验过程中通过加入阳性对照药物或工具药进行验证，使得实验得到的结果更加可靠。

CMC技术是一种从中药复杂体系中筛选活性成分的方法，具有多方面的优点，但也存在一定局限性。①CMC技术作为一种离体的活性成分筛选方法，不能使复杂的体内环境和体内其他影响中药药效发挥的因素被完全模拟出来。因此，采用CMC筛选活性成分时，需根据药物的体内代谢过程不断完善药理模型。②不同的中药活性成分在体内的作用靶点不同，制备生物材料的固定相细胞膜具有一定难度，不能完全保证实验的精密度和重复性，且存在保存时间短、难以实现商品化的问题。③多种活性蛋白存在于自然生物膜上，但标本量太少或收集困难，不能将此类生物膜用于大规模筛选和受体亚型的研究。解决该问题的方法是将重组受体和药物筛选相结合，将受体的配基、亚基和靶酶的活性中心等在细胞株或微生物中大量表达[31]。④CMC体系中，如果细胞膜对硅胶(固定相载体)包裹不全，可能由于硅胶的吸附性，使药物与细胞膜、膜受体之间的相互作用受到干扰。⑤被CMC柱特异性保留的有效成分的量通常很少，难以进行结构鉴定和药理活性确证。为解决该问题，可通过受体高表达细胞株的膜色谱制备，构建各种单一受体高表达的CMC体系，联用HPLC法、LC-MS法、光谱法、蛋白质组学等技术，建立细胞膜筛选平台以用于药物高通量筛选。

因此，对于CMC技术还需进行深入探索，充分利用其优势，使该技术在中药活性成分的筛选以及发现更多高效低毒的先导化合物方面发挥越来越大的作用。

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