HPLC法测定维吾尔药材阿勃勒中指标性成分的含量

郑梦成，高 艳，郭 爽，孙如煜，杜守颖*，白 洁*，陈 菊

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.新疆银朵兰维药股份有限公司，乌鲁木齐 830000)

阿勃勒是豆科植物腊肠树CassiafistulaL.的干燥成熟果实，现收载于《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》、《中国医学百科全书维吾尔医学卷》和《中华本草维吾尔卷》，异名为腊肠树果和清泻山扁豆[1-3]，是维吾尔医习用药材。阿勃勒可生湿生热、清除过剩黑胆汁、清热消炎、润肠通便和散气通经，常用于治疗干寒或体液烧焦沉淀引起的黑胆汁性炎肿、目赤肿痛、喉干便秘、关节痛、干咳和气喘等症[1]，临床常用于治疗异常胆液质所引起的便秘等症，多见于传统组方如通阻合牙日仙拜尔片、买提布合木来引汤和买提布合艾非提蒙汤等[2]。另外，阿勃勒在国外文献、藏药和傣药中均有记载，在印度，阿勃勒主要用于治疗皮肤病和保肝等，阿勃勒的原植物腊肠树也被用于治疗咳嗽、皮肤瘙痒和糖尿病等[4-5]；在藏药理论中，阿勃勒具有清热功效，能治疗肝病、实热便秘和四肢肿胀等，收载于藏族医药经典《月王药诊》、《四部医典》和《中国藏药》[6]；阿勃勒在傣族药典中被记载，主要用于抗菌和润肠通便[7]。现代研究表明，阿勃勒中含蒽醌类(如大黄酸)、缩合性鞣质等成分，种子中含有多种挥发性成分[8-11]。

目前，关于阿勃勒的研究相对匮乏，《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》中该药项下仅有性状和鉴别项，缺少必要的含量检测项目，无法有效控制药材质量。原标准鉴别项目提示：阿勃勒中含有蒽醌类成分，这与其临床用于治疗便秘等症的功效相契合，考虑阿勃勒中蒽醌类成分为其泻下作用的主要药效成分[8]，因此拟筛选含量较高的蒽醌类成分作为其含量测定的指标成分；建立指标性成分的含量测定方法，为其质量标准的完善提供依据，为更全面地评价阿勃勒药材及其相关制剂质量奠定基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司，SPD-M20A，PDA检测器，LC Solution色谱工作站)；BT 25S电子分析天平(北京赛多利斯公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)。

1.2试药 大黄酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110757-201607)；阿勃勒(批号160801，由新疆银朵兰维药股份有限公司提供)，按照《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》、《中国药典》2015年版四部检验，符合规定；乙腈(Sigma公司，色谱级)；磷酸(TED公司，分析纯)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；甲醇为分析纯；其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1指标性成分的筛选 参考《中国药典》2015年版大黄项下[12]游离蒽醌及总蒽醌的提取方法，选择蒽醌类代表性成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品进行色谱图比对。

2.1.1芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的色谱比对 色谱条件：Diamosil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸 (47∶53)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为30℃，进样体积为20 μL。HPLC图见图1。

图1芦荟大黄素、大黄酸、大黄素与阿勃勒样品的HPLC对比图

A.混合对照品；B.游离蒽醌样品；C.总蒽醌样品；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素。

Fig.1 Comparison of HPLC chromatograms of aloe-emodin，rhein，emodin and samples of Abole

A.mixed reference substances；B.sample of free anthraquinones；C.sample of total anthraquinones；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin.

2.1.2大黄酚和大黄素甲醚的色谱比对 色谱条件：Diamosil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸(57∶43)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃，进样体积为20 μL。HPLC图见图2。

由图1～2可知，阿勃勒游离蒽醌样品及总蒽醌样品中均可检出大黄酸，而不可检出其余4种，因此，确定大黄酸为阿勃勒中含量测定的指标性成分。

2.2指标性成分含量测定方法的建立

2.2.1色谱条件 Diamosil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-1 mL·L-1磷酸(47∶53)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃，进样体积为20 μL。在上述色谱条件下进行分析，大黄酸保留时间为15 min，分离度良好，色谱图见图3。

图2大黄酚、大黄素甲醚与阿勃勒样品的HPLC对比图

A.混合对照品；B.游离蒽醌样品；C.总蒽醌样品；4.大黄酚;5.大黄素甲醚。

Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms of chrysophanol，physcion and samples of Abole

A.mixed reference substances；B.sample of free anthraquinones；C.sample of total anthraquinones；4.chrysophanol；5.physcion.

图3阿勃勒对照品、供试品和阴性对照品的HPLC图

A.对照品；B.阿勃勒样品；C.阴性对照；1.大黄酸。

Fig.3 HPLC chromatograms of Abole reference substance，sample and negative control

A.reference substance；B.sample of Abole；C.negative control；1.rhein.

2.2.2混合对照品溶液的制备 取大黄酸对照品0.84 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液的制备 取阿勃勒药材，粉碎，过4号筛，称取1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入100 mL甲醇，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.4阴性样品溶液的制备 按照2.2.3项下方法制备阿勃勒阴性样品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察 分别精密移取2.2.2项下制备的混合对照品溶液1 mL，分别置于2，5，10，25和50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得系列质量浓度的对照品溶液，测定峰面积。按照2.2.1项下色谱条件分别进样20 μL，记录色谱图。分别以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，进行线性回归，得大黄酸的回归方程为y=72 308x-36 833 (r=0.999 8)，结果表明，大黄酸质量浓度在1.68～84.00 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.2精密度考察 按照2.2.1项下色谱条件，取2.2.2项下制备的混合对照品溶液20 μL，重复进样6次，以大黄酸峰面积计算RSD值为0.29%，结果表明，仪器精密度良好。

2.3.3稳定性考察 取2.2.3项下制备的阿勃勒供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件，在0，2，4，6，12和24 h进样，进样体积20 μL，测得大黄酸的峰面积RSD值为0.68%，结果表明，阿勃勒供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4重复性考察 取同一批阿勃勒粉末6份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进样，进样体积为20 μL，测得大黄酸的平均含量为0.335 6 mg·g-1，RSD值为1.52%，结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5加样回收率考察 取已知含量的阿勃勒粉末0.5 g，精密称定，加入一定量的大黄酸对照品溶液，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按照2.2.1项下色谱条件进样，测定大黄酸的含量，计算平均回收率及RSD值，结果表明，大黄酸的平均加样回收率为99.87%，RSD值为1.01%。见表1。

表1大黄酸的加样回收率实验结果

Tab.1 Results of rhein recovery test

编号取样量/g样品中含量/mg加入对照品量/mg测定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.50040.16790.18000.3485100.3299.871.0120.50010.16780.18000.347699.8730.50010.16780.18000.347899.9840.50010.16780.18000.344898.3450.50060.16800.18000.346899.3160.50070.16800.18000.3505101.38

2.4不同批次阿勃勒中大黄酸的含量测定 6批阿勃勒样品均由新疆银朵兰维药股份有限公司提供，按照《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》检验，符合规定。精密称取各批次阿勃勒粉末1 g，过4号筛，平行操作3份，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件测定大黄酸的含量，样品采集信息及测定结果见表2。

表2样品采集信息及测定结果

Tab.2 Sample collection information and determination results

(n=3)

3 讨论

本实验采用HPLC 法测定阿勃勒药材中指标性成分大黄酸的含量，线性关系良好，精密度、重复性、回收率均符合要求，该方法简便易行，可为阿勃勒质量标准的建立和完善提供实验依据。

3.1含量测定指标成分的筛选 现代研究表明，阿勃勒含蒽醌类成分，如大黄酸、芦荟大黄素苷、甲氧基蒽醌及鞣质等成分[1]。本实验通过进行大黄酸等对照品比对，确定阿勃勒中蒽醌类成分为大黄酸，综合考虑蒽醌类为其泻下作用的药效成分，最终选择大黄酸作为其含量测定指标性成分，并建立阿勃勒中大黄酸的含量测定方法。

3.2色谱条件的选择 大黄酸在中药材及中成药中的含量测定方面已有众多文献报道[13-17]，本实验考察了甲醇-0.5 mL·L-1磷酸、甲醇-1 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1磷酸，发现使用流动相为后者时杂质干扰较少，分离度较好。考察乙腈-1 mL·L-1磷酸不同比例，最终选择最佳比例为47∶53，此时色谱峰分离度好、保留时间适宜、线性关系和重复性良好。

3.3供试品溶液及其制备方法的考察 以大黄酸含量为指标，对供试品溶液的制备方法进行单因素考察，包括：提取方法(回流法、超声法)，提取溶剂(体积分数为50%的甲醇、体积分数为75%的甲醇和甲醇)，提取溶剂用量(25，50，100和150 mL)，提取时间(0.5，1.0，1.5和2.0 h)以及药材粉碎粒度(过3，4号筛)，通过SAS软件进行数据分析，最终确定最佳供试品溶液的制备方法。

3.4结果分析 在所测的6批阿勃勒药材中，均能检测到大黄酸，但产地、来源不同，含量差异明显；同一产地不同批次药材间大黄酸含量亦有较大差异，如第1批与第5批大黄酸含量相差约20%，推测阿勃勒的储存条件等也会对其含量产生影响，这提示我们在生产实践中应注意采收时间、控制药材储存条件和药材来源。本实验同时对阿勃勒不同部位的大黄酸含量进行测定，结果显示，大黄酸主要存在于果壳中，种子中含量极少，同一果实中果壳中的大黄酸总量为种子中的265倍。种子中大黄酸含量虽少，但研究表明种子中含有脂肪油和树胶等[2，10]，有润下作用，与果实中所含的蒽醌类成分的泻下作用相协调，具有润肠通便作用，入药时不必舍去。

本实验中仅检测6个批次，各批次间差异较大，若要进一步制定阿勃勒含量测定标准，则需积累一定批次，制定最低标准，在生产相关制剂的过程中则需控制药材来源。

维吾尔医药作为一个具有独特实践和理论的医药体系，是祖国医药不可缺少的部分，但其质量标准研究存在着化学研究起步较晚、相对落后的问题，限制了临床应用及新药开发[18-19]。目前，维吾尔药材面临着质量标准不健全甚至缺失的现状，亟待提高标准[20]。阿勃勒作为维吾尔医习用药材，临床应用广泛，但质量标准研究相对较少，《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》中仅有薄层鉴别项，无含量测定项，本实验综合考虑含量测定结果与药效作用，选择大黄酸作为其含量测定指标性成分，首次建立了阿勃勒中大黄酸的含量测定方法，该液相方法简便、准确，可为其质量标准的完善、临床用药安全、合理开发提供参考依据。

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