6种胃液游离microRNAs对胃腺癌的诊断价值

陈妍洁， 吴 昊， 董 玲， 刘韬韬， 沈锡中*

1. 复旦大学附属中山医院消化科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院上海肝病研究所，上海 200032

胃癌在全球占肿瘤发病率的第4位，致死率也较高[1-2]。其中，近年来每年约75%的新发病例来自于亚洲[1-2]。目前，临床上胃癌的无创诊断标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的灵敏性和特异性均不高，对胃癌早期诊断作用不明显，而胃癌诊断的早晚决定患者的预后。因此，对于新型胃癌诊断标志物的探索显得尤为重要。MicroRNAs(以下简称miRNAs)是一类保守的非编码RNA分子，通常由18～24个核苷酸组成[3-4]。目前认为其在胃癌的发病中起至关重要的作用。多项研究[5-12]发现，一些miRNAs在胃癌组织和癌旁组织中的表达存在差异。有研究[13]发现，miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-106b、miR-378和miR-638在胃癌组织中表达异常，其中6个miRNAs(miR-17, miR-18a, miR-20a, miR-21, miR-106b、miR-378)在胃癌及癌旁组织中的表达存在差异。

目前，多项研究[14-16]发现，胃癌患者外周血及胃液中的癌症相关miRNAs表达也发生了改变。由于胃液属于胃癌肿瘤微环境的组成部分，因此胃液中miRNAs的表达与胃癌细胞的发生、发展联系更加紧密，可反映胃癌细胞的旁分泌情况。因此，本研究选取上述6个胃癌相关miRNAs，分析其在胃癌患者胃液中的表达，并探讨其作为胃癌诊断标志物的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月至12月于复旦大学附属中山医院进行胃镜检查的53例患者，包括24例胃腺癌患者、16例胃溃疡患者和13例慢性胃炎患者。胃腺癌患者入选标准：(1)病理确诊为胃腺癌；(2)在胃镜检查前未接受化疗或放疗等肿瘤相关治疗。胃溃疡患者入选标准：(1)病理诊断排除恶性溃疡；(2)药物治疗后溃疡愈合。慢性胃炎患者入选标准：病理诊断包括慢性非萎缩性胃炎(伴或不伴肠化生)、慢性萎缩性胃炎(伴或不伴肠化生)。所有患者病灶无活动性出血，检查前12 h禁食。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 样品处理和miRNAs提取 胃液在活检前取出，4℃下 3 000×g离心10 min，取上清分装后保存在-80℃冰箱中。Cel-miR-39(广州市锐博生物科技有限公司)作为外源性内参加入胃液中，浓度为1×10-2pmol/L。

胃液总miRNAs按照miRcute miRNAs Isolation Kit[天根生化科技(北京)有限公司]说明书提取，具体过程如下：200 μL胃液中加入等体积裂解液MZ，震荡器震荡混匀30 s；室温放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离；室温13 400×g，离心10 min，取上清，转入1个新的无酶离心管中；加入200 μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15 s，室温放置5 min；室温13 400×g离心15 min，取上层无色水相层至新管中；缓慢加入1/3体积的无水乙醇并混匀，将混匀液体转入吸附柱miRspin，室温放置2 min，室温13 400×g离心30 s，保留流出液；加入流出液体积2/3的无水乙醇并混匀，转入吸附柱miRelute，室温放置2 min，13 400×g离心30 s，离心后弃去流出液，保留吸附柱；向吸附柱miRelute中加入500 μL去蛋白液MRD，静置2 min，室温13 400×g离心30 s，弃废液；向吸附柱miRelute中加入600 μL漂洗液RW，静置2 min，室温13 400×g离心30 s，弃废液；向吸附柱miRelute中加入600 μL漂洗液RW，静置2 min，室温13 400×g离心30 s，弃废液；将吸附柱miRelute放入2 mL收集管中，室温13 400×g离心1 min，去除残余液体；将吸附柱miRelute转入1个新的离心管中，加入30 μL无酶DD水，室温放置2 min，13 400×g离心2 min。得到的总miRNAs保存在-80℃冰箱中。

总miRNAs采用miRcute miRNAs First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]反转录成cDNA：(1)在miRNAs的3′端加入Poly(A)尾；(2)将Poly(A)尾修饰过的miRNAs反转录成为cDNA。

1.3 qRT-PCR半定量miRNAs miRNAs的PCR反应采用miRcute miRNAs qPCR Detection Kit试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]。miRNAs的引物序列见表1。将每个样品进行40个周期的循环反应：94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃扩增32 s。相对miRNAs计算公式为2-ΔCt[ΔCt = Ct (miRNAs) - Ct (内参)][17]。

表1 miRNAs的引物序列

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行分析。两组间miRNAs的表达采用非参数检验Mann-Whitney。用ROC曲线下面积(AUC)对miRNAs的诊断效能进行评估。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 患者基本信息 24例胃癌患者中，男性17例，女性7例；年龄38～86岁，平均(65.92±11.03)岁。13例慢性胃炎患者年龄为28～82岁，平均(65±8.01)岁；16例胃溃疡患者年龄为34～80岁，平均(66±11.88)岁。由慢性胃炎和胃溃疡患者组成的对照组中，男性21例，女性8例。胃癌组和对照组患者年龄和性别差异无统计学意义。24例胃癌患者CEA、CA199、CA724这3项肿瘤指标中至少有1项为阳性，其中19例患者CEA阳性、1例CA724阳性、1例CEA和CA199阳性、2例CEA和CA724阳性、1例3项指标均为阳性；对照组中有6例至少有1项肿瘤标志物为阳性，其中1例为CEA阳性，5例为CA724阳性。

2.2 两组间6个胃液miRNAs的表达差异 结果(图1)显示：胃癌患者胃液中miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-21和miR-378较对照组上调(P<0.05；两组胃液miR-106b差异无统计学意义。

2.3 ROC曲线分析miRNAs诊断效能 结果(图2、表 2)显示：miR-17、miR-18a、miR-21和miR-378诊断胃癌的效能中等；miR-20a和miR-106b诊断胃癌的效能较低。

图1 胃癌相关miRNAs在胃液中的表达

图2 胃癌相关miRNAs的诊断效能

miRNAAUC95%CI上限95%CI下限敏感性特异性miR-170.7100.5700.8500.5830.793miR-18a0.7390.6060.8710.4580.931miR-20a0.6840.5410.8270.7920.552miR-210.7170.5780.8560.4580.966miR-106b0.6410.4920.7900.8750.414miR-3780.7210.5850.8580.7500.586

3 讨 论

大量研究[14-16]发现，组织和血液中的miRNAs可作为胃癌的诊断和预测标志物。但是，对于胃液中miRNAs的研究目前还较少。胃液作为直接接触胃癌组织的体液，属于胃癌的肿瘤微环境组成之一，可直接反映肿瘤的发生、发展、侵袭、迁移，且临床上较易获得。因此，胃液中所含的小分子物质有较高的诊断特异性，可成为胃癌早期的诊断标志物。另外，也有研究[18-19]显示，不同的温度、时间、pH值、酶消化及冻融循环都难以改变体液中miRNAs的含量，提示体液中miRNAs具有相对稳定和抗降解的特性。虽然，目前尚未证明miRNAs在胃液中也具有同样的稳定性，但是我们在实验过程中发现，离心取上清后采用-80℃的保存方式并不影响后续的qRT-PCR实验，且miRNAs的相对表达量较为恒定，提示胃液中的miRNAs也有较好的稳定性，可能成为未来胃癌无创诊断的标志物之一。

本研究选取了系统综述胃癌组织中表达有明显差异的6个miRNAs在胃液中进行验证[13]，并探讨其对胃癌的诊断价值。本研究发现，这6个miRNAs在胃癌患者的胃液中表达均有升高，其中，miR-17、miR-18a、miR-21和miR-378在癌和癌旁组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05)，且具有中等诊断效能。这些结果初步表明，胃液中的miRNAs可作为胃癌早期诊断的标志物。但是，本研究进行Logistic回归时未能将6个miRNAs整合。

胃癌患者胃液中miRNAs变化趋势与胃癌组织中miRNAs的表达不完全一致。文献[13]报道，miR-378在胃癌组织中表达较正常癌旁组织有所降低，而本研究结果相反。有研究[20]认为，一方面，胃癌细胞在生长过程中伴随大量坏死，坏死细胞被动释放大量的miRNAs于胃液中；另一方面，肿瘤细胞会主动释放含有miRNAs的微囊泡至胃液中，以精细调控肿瘤微环境，并向远处的细胞传递细胞信号，促进肿瘤的发生、发展和转移。但这些理论还有待进一步研究。

将胃液miRNAs作为胃癌诊断标志物的优势在于：首先，胃液由胃黏膜直接分泌，相比于血清或者血浆中的miRNAs，受全身其他疾病的影响较小，因此对于胃癌的诊断更具特异性；其次，胃液可通过胃镜和胃管获得，适用于长期服用抗凝药物不能活检、早期胃癌胃镜下难以识别以及无法行胃镜检查的患者；再次，目前miRNAs的提取和检测手段越来越成熟。

然而，胃液中miRNAs的检测也面临许多挑战。首先，试验前饮水、唾液分泌、病灶活动性出血等使胃液的质控较难，进而改变胃液中miRNAs的表达；其次，胃液中miRNAs对胃酸环境的稳定性要求及其储存条件尚未标准化；再次，幽门螺杆菌的感染是否影响胃液中miRNAs的表达水平目前尚不明确。

综上所述，本研究发现，胃液中的miRNAs可作为早期胃癌的诊断标志物。虽然本研究的样本量较少，但采用了系统综述的结果，选取胃癌患者表达阳性率最高的6个miRNAs，且对照组同时纳入了胃溃疡和慢性胃炎的患者，结果的准确性较高。另外，实验对于胃液的储存和处理都严格质控，及时处理，减少不同胃液质量所造成的偏差，可保证结果的可靠性。在后续实验中，将扩大样本量，并在对照中加入其他胃癌癌前病变(如中高级别上皮内瘤变)或间质瘤、平滑肌瘤等病变，以期提高胃液miRNAs作为胃癌诊断指标的特异性，并进一步研究胃液中miRNAs的改变与肿瘤分化、侵袭、转移的相关性及其调控机制。

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