高寒区牛内脏组织的采集及其RNA的贮存

侯明杰，张 霞，石福于，王虎成(1.草业科学国家级教学示范中心(兰州大学)，甘肃 兰州 730020； 2.草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原地区的特有畜种，也是“世界屋脊”著名的景观牛种，主要分布在海拔3 500 m以上的高山草原，是青藏高原牧区人民的主要生活和经济来源[1]。牦牛在高寒、缺氧和枯草期长达半年的严峻自然条件下，经过长期自然选择和自身适应已具有独特的生物学特性[2-3]，科学认知并利用这一神奇的物种，研究其高寒营养适应性显得尤为必要，但因牦牛所处环境及生物习性明显不同于普通牛，传统的营养学研究方法在这一物种上的应用受到限制，研究新的方法与技术显得尤为必要。近年来，分子生物技术在动物基因的表达及调控中的应用受到广泛关注，而其研究主要建立在转录组的基础上，得到完整的RNA是试验的关键。但是，动物组织离开活体后RNA极不稳定，极易被广泛存在且难以消除的内源或外源RNA酶降解，使得高质量RNA不易获得，故合理提取并保存组织RNA 至关重要[4-5]。在试验过程中，有时由于样本量较大、提取总RNA时间较长等原因，提取总RNA后不能迅速进行后续试验， 使得提取出的总RNA必须贮存一段时间。研究发现，大鼠海马组织总RNA样品可在-70 ℃下保存60 d，反复冻融3次后总RNA质量基本不变[6]；全血RNA在37 ℃保存7 d时发生明显降解[7]。然而，针对高寒区牦牛和本地黄牛总RNA长时间保存后的质量分析未见报道，这势必不利于宝贵资源的高效利用。

此外，在以往的研究中，对RNA浓度及纯度通过Nano-drop 2000来检测[8]，RNA的完整性通过凝胶电泳条带，并利用其积分光密度值(integrated optical density，IOD)或灰度值来表示RNA的含量[6,9]，研究发现凝胶电泳图的IOD与电泳条带RNA的百分含量具有正比关系[10-11]；RNA的百分含量能够直接表现出RNA 28S、18S和5S比例，28S条带亮度是18S的2倍[12-13]，且28S和18S的百分含量比接近于2∶1[14-15]，利用此优点可更加直观表示RNA各条带百分含量及降解程度。此外，近年来，围绕牦牛营养代谢高寒适应性研究，经常以生活于同一生境的本地黄牛为参照对象[16]，鉴于此，本研究以天祝白牦牛及同一生境黄牛为对象，研究其组织RNA质量检测技术以及短期和长期保存RNA的质量的变化，旨在为该区域动物分子营养学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物 试验地位于甘肃省天祝藏族自治县乌鞘岭地区(37°12.479′ N，102°51.695′ E)，海拔3 154 m，气候寒冷潮湿，昼夜温差大，年均气温-0.1 ℃[17]。2015年9月在试验地选取3周岁体况相近、健康状况良好的天祝白牦牛及本地黄牛各3头做为供试动物，屠宰采样前于乌鞘岭天然草地放牧饲养。

1.1.2仪器和试剂 TGL-16台式高速冷冻离心机(长少平凡仪器仪表有限公司)；WD9413C凝胶成像系统(上海楚柏实验室设备有限公司)；DYY-6D稳压稳流型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；超净工作台(苏净安泰公司)；Nano-drop 2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo公司)；-86 ℃超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)。

Trizol Universal RNA Extraction Kit购自Invitrogen公司；6×Loading buffer，DEPC均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1胃肠道及肝肾组织采集与初级保存 前述试验动物经24 h禁食后经颈静脉放血屠宰，分离胃(瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃)，小肠(十二指肠、空肠、回肠)，大肠(盲肠、结肠)，肝脏和肾脏组织。其中：胃组织经冷生理盐水冲洗后，钝性剥离上皮层，进一步冲洗后分装于5 mL离心管于液氮罐速冻；每个肠段约20 cm用于肠粘膜采集，先用手术剪纵向切开肠段，冷自来水冲洗内容物，再用生理盐水冲洗后，置于冰冷的玻璃板，用载玻片刮取粘膜组织，粘膜分装于5 mL离心管于液氮罐速冻；切取肝、肾实质，冷生理盐水冲洗后分装于10 mL离心管，于液氮罐速冻，所有样品于离体10 min内完成。前述样品经液氮冻存，于第2天运输至实验室后转入-80 ℃冰箱保存，以备提取RNA[18]。

1.2.2组织RNA的提取与保存 用Trizol Kit提取上述保存样品的RNA。操作步骤：1)称取低温冻结的组织50～100 mg后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，转移至1.5 mL离心管中，加1 mL Trizol试剂对组织进行裂解；2)用力混匀至清澈，冰上放置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，将上清液转移至另一个1.5 mL离心管中；3)加入0.2 mL氯仿，反复振荡摇匀，室温静置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心15 min；4)小心吸取上层水相置于另一无菌1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，轻柔颠倒数次混匀，室温静置15～20 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，弃上清，加1 mL 75%乙醇洗涤两次；5)沉淀的RNA室温自然干燥，用50～70 μL DEPC灭菌水重悬保存。整个操作过程在超净工作台内冰上进行，防止RNase污染。

1.2.3RNA品质检测与分析 提取的组织RNA样品在-80 ℃保存，分别于1个月和23个月测定其浓度及降解程度。

RNA浓度：用Nano-drop 2000超微量核酸蛋白测定仪检测。

RNA的降解程度分析：取RNA样品(23月)5 μL与2 μL上样缓冲液混匀，在含3 μL核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶点样，120 V电泳30 min，测定其完整性。

凝胶电泳图分析：利用Gel-pro软件对凝胶电泳图进行分析，测定每个条带28S、18S和5S IOD值及百分含量。

1.2.4数据计算与分析 RNA浓度以均值和标准误表示(mean ± SD)，根据食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)标准生物样品规则[6]，利用RE表示RNA浓度的稳定性。即：RE=(不同保存时间的样品浓度-初始浓度)/初始浓度，当-15%≤RE≤15%时表明样品浓度稳定。RNA降解程度以28S∶18S来表示。利用SPSS 20软件对RNA浓度，RE和28S、18S、5S百分含量进行均值计算以及对RE和28S∶18S进行配对检验。

2 结果

2.1 贮存时间对牦牛及黄牛组织RNA浓度的影响

牦牛和黄牛胃部RNA在-80 ℃保存23个月后RNA不稳定(RE>15% 或<-15%)(表1)。牦牛所有胃组织样品RNA放置23个月后浓度均增加，而黄牛的瘤胃及瓣胃却呈相反情况；牦牛和黄牛小肠各肠段RNA浓度变化不尽相同；其中，两个基因型牛种空肠及牦牛回肠组织RNA相对稳定；十二指肠RNA浓度变幅最大(RE=288.55%)。黄牛结肠RNA浓度在保存23个月后较保存1个月有所降低，浓度不稳定；牦牛盲肠与结肠和黄牛盲肠RNA浓度有变化，但都相对稳定；牦牛和黄牛大肠RNA在保存23个月后稳定性存在显著差异(P<0.05)；黄牛肾脏组织RNA相对稳定，但黄牛肝脏、牦牛肾脏和肝脏均超出了RE所推荐的稳定范围。说明不同品种、不同组织贮存时间对RNA的浓度影响不同。

2.2 贮存时间对RNA降解程度的影响

将-80 ℃保存1个月的所有组织RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，图1为随机抽取样品电泳图。28S、18S两条带清晰，5S条带不清晰，且28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍，表明品质良好。

2.2.1超低温贮存23个月后牦牛及黄牛胃部组织RNA降解程度 牦牛和黄牛胃部RNA在-80 ℃保存23个月后的电泳条带显示，5S条带最亮，28S和18S条带较弱(图2和图3)。利用Gel-pro软件对凝胶电泳图分析28S、18S和5S百分含量(表2)，结果显示：牦牛瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃28S∶18S均小于2，在0.51～0.86，且5S百分含量均高于28S；黄牛瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃28S∶18S均小于2，在0.34～0.52，黄牛瘤胃和网胃5S含量高于28S，但瓣胃和皱胃5S含量低于28S。说明牦牛和黄牛胃部RNA发生了明显的降解，但不同品种、不同组织降解程度不同。

2.2.2超低温贮存23个月后牦牛及黄牛小肠组织RNA降解程度 牦牛和黄牛小肠RNA经-80 ℃保存23个月后电泳发现，除黄牛空肠3号样品RNA 5S条带比较明显外，其他组织均不明显，且28S条带和18S条带亮度没有区别(图4)。利用Gel-pro软件对凝胶电泳图分析28S、18S和5S百分含量，结果显示，牦牛空小肠28S∶18S均接近1，说明降解不明显，牦牛和黄牛十二指肠RNA浓度发生了不同的变化(表3)。

表1 贮存时间对牦牛及黄牛胃肠道、肝脏和肾脏RNA浓度的影响Table 1 Effect of storage duration on RNA concentration in the gastrointestinal, liver, and kidney tissues of yak and cattle

同列不同小写字母表示相同组织不同品种间差异显著(P<0.05)，下表同。RE,RNA浓度的稳定性。

Different lowercase letters indicate significant difference in the same tissue among different species at the 0.05 leve; similarly for the following tables. RE, stability of RNA concentration.

图1 牦牛及黄牛部分组织RNA电泳图Fig. 1 Image of electrophoresis of RNA from different tissues of yak and cattle

1，表示牦牛瘤胃RNA；2，表示黄牛回肠RNA；3，表示牦牛肝脏RNA。

1, indicate RNA from yak rumina; 2, indicate RNA from cattle ileum; 3, indicate RNA from yak liver.

图2 牦牛及黄牛瘤胃和网胃RNA超低温储存23个月后的降解程度Fig. 2 Degradation degrees of RNA from rumina and reticula of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黄牛网胃RNA；4、5、6表示牦牛网胃RNA；7、8、9表示黄牛瘤胃RNA；10、11、12表示牦牛瘤胃RNA。

1, 2 and 3 indicate RNA from cattle reticula; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak reticula; 7, 8 and 9 indicate RNA from cattle rumina; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak rumina.

图3 牦牛及黄牛瓣胃和皱胃RNA超低温储存23个月后的降解程度Fig. 3 Degradation degrees of RNA from omasa and abomasa of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黄牛皱胃RNA；4、5、6表示牦牛皱胃RNA；7、8、9表示黄牛瓣胃RNA；10、11、12表示牦牛瓣胃RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle abomasa; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak abomasa; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle omasa; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak omasa.

图4 牦牛及黄牛小肠RNA超低温储存23个月后的降解程度Fig. 4 Degradation degrees of RNA from small intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黄牛空肠RNA；4、5、6表示牦牛空肠RNA；7、8、9表示黄牛回肠RNA；10、11、12表示牦牛回肠RNA；13、14、15表示黄牛十二指肠RNA；16、17、18表示牦牛十二指肠RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle jejuna; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak jejun; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle ilea; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak ilea; 13, 14, and 15 indicate RNA from cattle duodena; 16, 17, and 18 indicate RNA from yak duodena.

表2 牦牛及黄牛胃部RNA超低温储存23个月后的降解程度Table 2 Degradation degrees of RNA from gastric tissues of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

表3 牦牛及黄牛小肠RNA超低温储存23个月后的降解程度Table 3 Degradation degrees of RNA from small intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

2.2.3超低温贮存23个月后牦牛及黄牛大肠组织RNA降解程度 牦牛及黄牛盲肠和结肠RNA在经-80 ℃保存23个月后，经电泳发现,RNA 5S条带均不明显(图5)。利用Gel-pro软件分析发现(表4)，牦牛盲肠和结肠RNA 28S∶18S值低于黄牛盲肠和结肠，且均小于1，说明RNA产生了降解。

图5 牦牛及黄牛大肠RNA超低温储存23个月后的降解程度Fig. 5 Degradation degrees of RNA from large intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黄牛结肠RNA；4、5、6表示牦牛结肠RNA；7、8、9表示黄牛盲肠RNA；10、11、12表示牦牛盲肠RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle colons; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak colons; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle ceca; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak ceca.

2.2.4超低温贮存23个月后牦牛及黄牛肝脏和肾脏组织RNA降解程度 牦牛及黄牛肾脏和肝脏RNA在-80 ℃保存贮存23个月后的电泳条带5S最亮，28S和18S条带较弱(图6)。利用Gel-pro软件对凝胶电泳图28S、18S和5S RNA百分比含量进行分析(表5)，结果显示，牦牛及黄牛肝脏和肾脏5S RNA百分含量明显高于18S和28S；牦牛与黄牛肝脏和肾脏28S/18S值在0.50～0.67，说明牦牛及黄牛肝脏和肾脏RNA均发生了不同程度的降解。

图6 牦牛及黄牛肝脏和肾脏RNA超低温储存23个月后的降解程度Fig. 6 Degradation degrees of RNA from livers and kidneys of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黄牛肾脏RNA；4、5、6表示牦牛肾脏RNA；7、8、9表示黄牛肝脏RNA；10、11、12表示牦牛肝脏RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle kidneys; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak kidneys; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle livers; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak livers.

表4 牦牛及黄牛大肠RNA超低温储存23个月后的降解程度Table 4 Degradation degrees of RNA from large intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

表5 牦牛及黄牛肝脏和肾脏RNA超低温储存23个月后的降解程度Table 5 Degradation degrees of RNA from livers and kidneys of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

3 讨论

3.1 贮存时间对RNA浓度的影响

动物组织离开活体后RNA极不稳定，极易被广泛存在且难以消除的内源或外源RNA酶降解，使得高质量RNA不易获得，故合理采样并保存组织RNA至关重要。此外，由于牦牛所处环境及生物习性明显不同于普通牛，样品获取不易，如何将来之不易的样品最大限度地用于科学研究，长时间高效保存意义重大。李维凯等[6]研究发现，从海马新鲜组织中提取的RNA的浓度最高，不同保存条件及反复冻融3次后RNA浓度均有所降低；研究发现[7]，从新鲜全血中提取的RNA浓度最高，不同保存温度及保存时间的RNA浓度较新鲜提取均有所降低，但对于RNA纯度，各组间反复冻融次数对RNA纯度有显著影响，而保存时间对RNA纯度无显著影响；穆龙龙等[19]利用Trizol 法从小体积全血标本中获取足量有效的总RNA，不同保存条件全血中所获取的总RNA浓度存在差异，总RNA在-80 ℃下短期保存略有降解。张杰等[20]研究发现，在25(室温)、4、-20、-80 ℃下放置10 min提取的总RNA质量浓度随放置温度的降低而增加，放置于-80 ℃时，随放置时间的增加，提取的总RNA浓度增加。说明RNA保存条件及保存时间均会对RNA浓度产生影响。本研究发现，与保存1个月相比，在保存23个月后牦牛胃部和十二指肠与黄牛网胃、皱胃和十二指肠和肝脏RNA浓度均有不同程度的增加，可能是RNA降解产生增色效应导致[21-22]，但牦牛空肠、回肠、肾脏和黄牛回肠、肾脏RNA浓度有所降低；并且，牦牛和本地黄牛瓣胃、空肠、盲肠、结肠和肾脏RNA在保存23个月后呈现不同的变化趋势。可能由于牦牛和本地黄牛品种不同，其代谢强度不同，所产生的内源酶和外源酶活性不一造成。

3.2 贮存时间对RNA降解程度的影响

路俊峰等[23]研究发现，在-80 ℃保存4个月的肿瘤组织RNA经凝胶电泳发现，部分组织RNA电泳条带均不清晰，甚至无明显条带，RNA出现明显的降解。杨秀荣等[24]研究发现，在低温没有密封储存的情况下，RNA保存较长时间，完整性好；-70 ℃下RNA可以保存8个月，-20 ℃下RNA可以保存4个月；在其他温度条件下，若密封保存，4 ℃下可保存两周，10 ℃下可保存4 d以上，20 ℃下保存3 d时条带清晰，保存4 d时条带模糊，30 ℃下保存2.5 d时条带变得模糊，到3 d时全部降解，40 ℃下保存1 d时条带清晰，保存2 d时条带变得模糊，保存2.5 d时完全降解。毛君婷等[25]研究发现，提取的鸭肝脏组织总RNA在室温保存24 h时只发生了部分降解，-20 ℃保存的RNA，经过很长一段时间后，RNA仍保持着很好的完整性；李维凯等[6]研究发现，大鼠海马RNA在-20 ℃及-70 ℃保存30 d和60 d以及24 h反复冻融3次后经凝胶电泳发现，样品仍有清晰的28S和18S条带出现，说明RNA完整性较好；本研究中，牦牛及黄牛胃部及肝脏和肾脏RNA在保存23个月后经凝胶电泳，5S条带较清晰，28S和18S条带均不清晰，且亮度没有差别，说明RNA发生了明显降解；利用Gel-pro分析发现，牦牛瘤胃、网胃、皱胃和肝脏以及黄牛瘤胃、网胃、皱胃和肾脏5S条带百分含量均高于18S和28S，且28S∶18S在(1∶1.37)～(1∶2.96)，说明牦牛和黄牛胃部RNA发生了不同程度的降解。然而，牦牛及黄牛小肠和大肠组织RNA均有28S和18S两个清晰条带出现，但18S条带比28S亮，且牦牛小肠RNA 28S∶18S均接近1，说明降解不明显且存在物种和组织差异。

4 结论

高寒牧区动物胃肠道等组织经现场规范采样后迅速用液氮保存，可异地保存运输至生物实验室，按一定规程可提取到高质量的RNA样品；常规超低温保存1个月提取的内脏组织RNA样品可用于试验研究，但23个月常规方法保存该RNA样品，均会产生不同程度的降解，但降解程度亦存在动物基因型及组织部位的差异性；围绕高寒区反刍家畜内脏组织RNA样品高效保存技术及有效保存时间需做进一步研究。

References：

[1] 王彦星,郑群英,晏兆莉,卢涛.气候变化背景下草原产权制度变迁对畜牧业的影响:以青藏高原东缘牧区为例.草业科学,2015,32(10):1687-1694.

Wang Y X,Zheng Q Y,Yan Z L,Lu T.Institutional transition of grassland property rights and its impact on animal husbandry under the background of climate changes:A case study from eastern Qinghai-Tibet Plateau.Pratacultural Science,2015,32(10):1687-1694.(in Chinese)

[2] 杨志娟,张相锋,董世魁.甘肃临夏农牧交错区牦牛、犏牛易地育肥试验.草业科学,2015,32(1):119-124.

Yang Z J,Zhang X F,Dong S K.Study on the fattening the yak and yak-cattle crossbreed in the agro-pastoral transition zone in Linxia Prefecture of Gansu Province.Pratacultural Science,2015,32(1):119-124.(in Chinese)

[3] 罗惦,柴林荣,常生华,程云湘,侯扶江.我国青藏高原地区牦牛草地放牧系统管理及优化.草业科学,2017,34(4):881-891.

Luo D,Chai L R,Chang S H,Cheng Y X,Hou F J.Yak grazing management system sand optimization on the Qinghai-Tibet Plateau.Pratacultural Science,2017,34(4):881-891.(in Chinese)

[4] 王桂玲,黄东阳,刘戈飞.一种从动物组织中提取高质量总RNA的方法.生命科学研究,2003,7(3):275-278.

Wang G L,Huang D Y,Liu G F.An improved method of extracting high quality total RNA from animal tissues.Life Science Research,2003,7(3):275-278.(in Chinese)

[5] 杜迎彬,王志杰,杨冰,张晓华,黄倢.对虾组织样品中RNA的铵盐常温保存法及其效果.渔业科学进展,2013,34(3):88-96.

Du Y B,Wang Z J,Yang B,Zhnag X H,Huang J.Ammonium preservation of shrimp tissue RNA at normal temperature and its effects.Progress in Fishery Sciences,2013,34(3):88-96.(in Chinese)

[6] 李维凯,霍韬光,畅蓓,杨卉蕾,姜泓.保存条件对大鼠海马组织总RNA质量的影响.化学研究,2012,23(5):93-96.

Li W K,Huo T G,Chang B,Yang H L,Jiang H.Effect of storage condition on mass of total RNA in hippocampus of rat.Chemical Research,2012,23(5):93-96.(in Chinese)

[7] 何松哲,何慧,陈懿,陈羽,余道军.不同保存和处理方式对全血标本总RNA提取的影响.中国微生态学杂志,2015,27(2):223-226.

He S Z,He H,Chen Y,Chen Y,Yu D J.Effects of different preservation and processing methods on RNA isolation from whole blood.Chinese Journal of Microecology,2015,27(2):223-226.(in Chinese)

[8] 阮运杰.DNA凝胶电泳分析系统研究.哈尔滨:哈尔滨工程大学硕士论文,2012.

Ruan Y J.Analysis system of DNA gel electrophoresis.Master Thesis.Harbin:Harbin Engineering University,2012.(in Chinese)

[9] 雷国华,李俊诗.凝胶电泳图像背景影响的蛋白质含量计算方法.中国体视学与图像分析,1999(2):97-101.

Lei G H,Li J S.Effects of the background of gel electrophoresis digital images on the quantification of proteins.Chinese Journal of Stereology and Image Analysis,1999(2):97-101.(in Chinese)

[10] 王文红,张继领,银广悦,张龙.琼脂糖凝胶电泳法测定廊坊地区血清蛋白正常参考值.中国煤炭工业医学杂志,2005(9):957-958.

Wang W H,Zhang J L,Yin G Y,Zhang L.Normal reference values of serum protein with agarose gel electrophoresis in Langfang.Chinese Journal of Coal Industry Medicine,2005(9):957-958.(in Chinese)

[11] 雷国华,李俊诗,周峻岭.通过凝胶电泳数字化图像分析蛋白含量的改进方法.中国医学物理学杂志,1998(3):183-185.

Lei G H,Li J S,Zhou J L.Quantitative analysis of protein with gel electrophoresis digital images.Chinese Journal of Medical Physics,1998(3):183-185.(in Chinese)

[12] 王丹丹,肖向红,吴立舒,柴龙会,张晶钰,张建平.改良TRIzol法高效提取东北林蛙皮肤总RNA.野生动物学报,2012,33(3):127-128.

Wang D D,Xiao X H,Wu L S,Chai L H,Zhang J Y,Zhang J P.An improved TRIzol method to extract total RNA from skin tissue ofRanadybowskii.Chinese Journal of Wildlife,2012,33(3):127-128.(in Chinese)

[13] 易乐飞,穆亮亮,仲改.凡纳滨对虾总RNA完整性的正确评估.浙江农业学报,2016,28(12):2007-2013.

Yi L F,Mu L L,Zhong G.Assessment of integrity of total RNA extrated fromPenaeusvannamei.Acta Agriculture Zhejiang,2016,28(12):2007-2013.(in Chinese)

[14] 王华,李华.保存动物组织内RNA的方法改进.生物技术通报,2010(6):152-155.

Wang H,Li H.Improvement of methods for storing RNA of animal tissues.Biotechnology Bulletin,2010(6):152-155.(in Chinese)

[15] 王桂玲,刘戈飞,黄东阳.从动物组织提取高质量总RNA方法的改进.生物技术通讯,2003,14(6):512-514.

Wang G L,Liu G F,Huang D Y.An improved method of extracting high quality total RNA from animal tissues.Letters in Biotechnology,2003,14(6):512-514.(in Chinese)

[16] 王虎成.尿嘌呤衍生物排出量估测青藏高原牦牛瘤胃微生物蛋白产量研究.兰州:兰州大学博士学位论文,2009.

Wang H C.Urinary purine derivative excretion as a method for estimation of rumen microbial protein production of yak in Qing-hai Tibetan plateau.PhD Thesis.Lanzhou:Lanzhou University,2009.(in Chinese)

[17] 石福于,王毅,付晓悦,侯明杰,王虎成.不同放牧强度下祁连山东段草地生态系统氮磷计量特征.家畜生态学报,2017(3):61-66.

Shi F Y,Wang Y,Fu X Y,Hou M J,Wang H C.Metrological characteristics of nitrogen and phosphorus in grassland ecosystem under different grazing intensity in east of Qilian Mountain.Journal of Domestic Animal Ecology,2017(3):61-66.(in Chinese)

[18] Wang H C,Shi F Y,Hou M J,Fu X Y,Long R J.Cloning of oligopeptide transport carrier PepT1 and comparative analysis on PepT1 mRNA expression response to dietary nitrogen levels of yak (Bosgrunniens) and indigenous cattle (Bostaurus) on Qinghai-Tibetan Plateau.Journal of Animal Science，2016,94:3431-3440.

[19] 穆龙龙,赵志英,朱立.全血标本保存条件对人总RNA提取效率的影响.北京医学,2010,32(10):837-840.

Mu L L,Zhao Z Y,Zhu L.RNA Isolation from human blood:Impacts of sample-storage condition.Beijing Medical Journal,2010,32(10):837-840.(in Chinese)

[20] 张杰,武晶晶,赵飞飞,闫宇翔,赵志强.不同温度和不同放置时间对总RNA提取浓度和纯度的影响.实验技术与管理,2013(11):79-82.

Zhang J,Wu J J,Zhao F F,Yan Y X,Zhao Z Q.Effect of different temperature and different stored time on concentration and purity of total RNA isolation.Experiment Technology and Microecology,2013(11):79-82.(in Chinese)

[21] Sreevalsan T,Jr Lockart R Z,Jr Dodson M L,Hartman K A.Replication of Western equine encephalomyelitis virus.I.Some chemical and physical characteristics of viral ribonucleic acid.Journal of Virology,1968,2(6):558-566.

[22] 曾碧慧,张志刚.盐浓度、酸碱度及DNA浓度对增色效应实验的影响.实验室研究与探索,2001,20(1):43-45.

Zeng B H,Zhang Z G.Effect of different DNA concentration,pH value and salt concentration of solution on DNA hyperchromic experiment.Laboratory Research and Exploration,2001,20(1):43-45.(in Chinese)

[23] 路俊锋,陈宏,吴劲松,毛颖,周良辅.不同保存方法对脑胶质瘤和其周边组织RNA保存的研究.中国临床神经科学,2010,18(2):199-202.

Lu J F,Chen H,Wu J S,Mao Y,Zhou L F.Preservation of RNA for glioma tissue bank:Comparison of snap-frozen and RNA later solid tissue.Chinese Journal of Clinical Neurosciences,2010,18(2):199-202.(in Chinese)

[24] 杨秀荣,王庆容,刘惠茹.保存温度对黄颡鱼肝组织总RNA质量的影响.江苏农业科学,2016,44(11):258-260.

Yang X R,Wang Q R,Liu H R.Effect of storage temperature on total RNA in liver of yellow-head catfish meat.Jiangsu Agricultural Sciences,2016,44(11):258-260.(in Chinese)

[25] 毛君婷,史开志,文明,周碧君.高质量鸭肝脏组织总RNA的提取及稳定性测试.贵州农业科学,2009,37(9):140-142.

Mao J T,Shi K Z,Wen M,Zhou B J.Extraction and stability test of high quality total RNA in duck liver tissue.Guizhou Agricultural Sciences,2009,37(9):140-142.(in Chinese)