细胞焦亡信号转导机制及其在肾脏疾病发病中作用的研究进展

刘建铭，曹灵

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

既往研究认为，细胞死亡的方式包括坏死、凋亡和自噬等。而细胞焦亡(pyroptosis)是一种新发现的、不同于凋亡的程序性细胞死亡方式，其主要特征为依赖于炎性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)、细胞肿胀破裂、炎性因子外释引起炎症级联反应等，是对刺激因素一种过度的应答反应，其最终结果是造成了细胞的损伤。细胞焦亡信号转导途径可分为经典的Caspase-1依赖的细胞焦亡途径和非Caspase-1依赖的细胞焦亡途径。研究发现，细胞焦亡广泛参与中枢神经系统疾病、心血管系统疾病、肾脏疾病的发生发展。目前研究表明，细胞焦亡参与了多种肾脏疾病的发生发展，包括缺血再灌注肾损伤、糖尿病肾病、肾纤维化、晶体相关性肾病等。本文就细胞焦亡信号传导机制及细胞焦亡与肾脏疾病的研究进展进行概述。

1 细胞焦亡的定义及与细胞凋亡的区别

1.1 细胞焦亡的定义 细胞焦亡是一种促炎性程序性死亡方式。1992年Zychlinsky等[1]研究发现，福氏志贺菌可使感染的巨噬细胞发生程序性死亡，因其与凋亡有些共同的特征，如核固缩、Caspase依赖等，当时被认为是凋亡，但不同的是凋亡是Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9依赖的，而这种细胞死亡方式后来被证实是Caspase-1依赖的。1998年Hubert等[2]用福氏志贺菌感染Caspase-1基因敲除巨噬细胞，发现不会诱发细胞死亡。因此认为Caspase-1在这种细胞死亡方式中起着重要的作用。2001年Cookson等[3]首次以“细胞焦亡”来命名这种依赖于Caspase-1的程序性细胞死亡方式。

细胞焦亡可由多种内源及外源危险因素所触发，包括Caspase-1依赖的经典细胞焦亡途径和非Caspase-1依赖的细胞焦亡途径。前者途径中，Caspase-1前体首先被募集激活，活化的Caspase-1再激活下游IL-1β和IL-18前体，同时Caspase-1的激活也会切割GasderminD膜蛋白(GSDMD)，使细胞膜破裂，炎症因子(IL-1β、IL-18)、溶酶体等细胞内容物释放，从而导致炎症级联反应；而后者途径中，则由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11识别革兰阴性菌脂多糖(LPS)，再启动下游细胞焦亡信号通路。

1.2 细胞焦亡与细胞凋亡的区别 细胞焦亡与细胞凋亡均属于Caspase依赖的程序性细胞死亡方式，但两者在发生机制、细胞形态学改变等方面有明显的区别。①Caspase可引发细胞凋亡和细胞焦亡，但参与凋亡和焦亡信号通路的Caspase不同，凋亡相关的Caspase包括应答Caspase(Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10)和下游的效应Caspase(Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7)，而细胞焦亡相关的Caspase则为Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11；②焦亡细胞的细胞膜可形成直径1.1～2.4 nm的微孔，离子以及水分子等小分子进入细胞内导致细胞肿胀破裂，使炎性因子和溶酶体等内容物释放，引起炎症级联反应，相反凋亡细胞的细胞膜保持完整，其整个凋亡过程是非炎性的；③焦亡细胞也可出现染色质固缩，但其细胞核仍保持完整，焦亡细胞也可发生DNA损伤和TUNEL染色阳性，但与凋亡细胞相比其密度更低，其机制与细胞凋亡不同，凋亡细胞DNA损伤依赖于Caspase激活的DNA酶(CAD)，然而焦亡细胞的CAD仍结合于CAD的抑制因子ICAD，且DNA损伤并不是细胞破裂、降解的关键事件，因为阻断DNA损伤仍然可以发生细胞焦亡[4]。

2 细胞焦亡的信号传导机制

细胞焦亡途径分为经典的Caspase-1依赖的细胞焦亡途径和非Caspase-1依赖的细胞焦亡途径，非Caspase-1依赖的细胞焦亡途径由人源的Caspase-4、Caspase-5和鼠源的Caspase-11所介导，两种途径细胞的形态学改变相似。Caspase-1依赖的细胞焦亡途径主要包括炎性小体的组装、Caspase-1前体的激活、炎性因子(IL-1β、IL-18)的活化和效应分子GSDMD的裂解三个主要步骤，最终导致了细胞肿胀破裂、炎性因子释放等生物学效应。

2.1 经典细胞焦亡路径

2.1.1 炎性体的组装是细胞焦亡的起始 炎性体是细胞内大分子蛋白复合体，其在细胞内的主要作用是抵抗细菌、病毒等感染因素对细胞的损伤。炎性体主要由模式识别受体(PRRs)、Caspase-1前体、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)组成。PRRs可识别细菌、病毒等外源性微生物携带的病原相关分子模式(PAMPs)和细胞内源性损伤所释放的危险相关分子模式(DAMPs)，PRRs主要分为两大类：第一大类包括跨膜的Toll样受体(TLRs)和C型凝集素受体(CLRs)；第二大类包括定位于细胞内的RIG-I样受体(RLR)、黑素瘤缺乏因子2受体(ALR)、NOD样受体(NLRs)和γ干扰素诱导蛋白16(IFI16)蛋白，其中ALR与IFI16同属于PYHIN家族蛋白成员，也被称作HIN200蛋白家族[5]。目前研究发现，人类NLRs家族有22个成员，鼠源的NLRs家族有34个成员，2002年首次发现NLRP1可组装为炎性体复合物，其后逐渐发现了NLR家族成员NLRP3、NLRC4和PYHIN蛋白家族成员AIM2以及TRIM家族成员Pyrin也可以组装为炎性体复合物，同时越来越多的证据表明人源的NLRP2、NLRP7、IFI16和鼠源的NLRP6、NLRP12、IFI16也可以募集并激活Caspase-1前体，活化后的Caspase-1再激活下游相关细胞焦亡因子，因此炎性体复合物的组装是焦亡起始关键环节[6]。

2.1.2 下游Caspase-1前体的活化 NLRs蛋白家族成员主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRC4、NLRP12等，其分子结构都包括位于中间的中央核苷酸结合寡聚化结构域(NACTH)、羧基末端亮氨酸重复区(LRR)、N端的热蛋白结构域(PYD)或Caspase募集激活结构域(CARD)，人源的NLRP1包括N端的PYD结构域和C端的CARD结构域，而NRC4包括CARD结构域而无PYD结构域。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和IFI16分子结构包括N端的PYD结构域和C端的结合配体的造血干扰素诱导核蛋白结构域(HIN200)[11]。Pyrin蛋白同样包括PYD结构域。ASC是Caspase-1的衔接蛋白，其结构包括N端的PYD结构域和C端的CARD结构域。

NLRs C端亮氨酸重复区(LRR)参与自身抑制，其主要功能是识别配体传递信号，中间的NACTH结构域参与炎性体组装过程中的同源或异源寡聚化的调节。NLRs被相关危险因子识别后可通过其N端的PYD结构域，与含有PYD结构域的ASC结合，从而间接募集激活Caspase-1前体，而NLRP1、NLRC4可直接利用其自身的CARD结构域募集并激活Caspase-1前体[7]。AIM2的HIN200结构域结合胞质dsDNA，而IFI16既能感受胞质dsDNA也能感受胞核dsDNA，被dsDNA识别活化的AIM2和IFI16可通过其PYD结构域与ASC的PYD结构域结合，再通过ASC的CARD结构域募集激活下游的Caspase-1前体[8]。磷酸化的Pyrin与14-3-3蛋白结合而处于失活状态，14-3-3蛋白以同源/异源二聚体形式存在，其主要功能是结合磷酸化蛋白的丝氨酸和苏氨酸，从而影响靶蛋白的结构、功能。当受到细菌毒素刺激时可使RhoA失活，Pyrin去磷酸化，去磷酸化的Pyrin与14-3-3蛋白分离，从而使CARD结构域得以激活Caspase-1，诱导细胞焦亡[9]。

2.1.3 GSDMD是细胞焦亡的关键效应分子 炎性体可通过剪切活化Caspase-1前体，从而激活下游的IL-1β、IL-18，但Caspase-1及IL-1β等如何导致焦亡目前仍不完全清楚。2015年Shi等[10]用CRISPR/Caspase-9基因组编辑技术，对Caspase-1和Caspase-11介导的小鼠巨噬细胞焦亡通路进行了全基因组范围遗传筛选，发现GSDMD蛋白可能为炎性Caspase的效应分子。Gsdermn蛋白家族成员包括GSDMD、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME(DFN5)和DFNB59。人类GSDMD蛋白的N端由242个氨基酸组成，C端由199个氨基酸组成，其N端与C端通过一个含有43个氨基酸的结构连接起来。未受焦亡信号刺激的细胞其完整的GSDMD分子的N端结构域和C端结构域可相互作用，表现出自身抑制现象，当炎性Caspase切割GSDMD蛋白的N端和C端的连接结构时，就会解除GSDMD的自身抑制作用，其N端结构域即可迁移至细胞膜位置，与细胞膜膜磷脂、磷酸肌醇和双磷脂酰甘油结合，且大约16个N端结构域单体寡聚化从而使细胞膜形成直径为10～14 nm的微孔，钠离子及水分子内流，钾离子外流，细胞肿胀、破裂，胞质内容物及炎性因子释放，导致炎症级联反应[11]。Shi等[10]也发现GSDMD缺陷的巨噬细胞不会影响IL-1β/18的成熟，但会影响其释放，说明GSDMD蛋白导致的细胞孔洞形成，是IL-1β/18外释的必要条件。

2.2 非经典细胞焦亡路径 研究发现，生物界不仅存在经典的细胞焦亡路径，也存在非经典的细胞焦亡路径，其由人源的Caspase-4、Caspase-5及鼠源的Caspase-11所介导。Baker等[12]发现Caspase-4、Caspase-5在LPS诱导的人巨噬细胞焦亡中起着重要的作用。与经典途径不同的是，细菌脂多糖并不是通过模式识别受体与ASC、Caspase前体组装成复合物活化Caspase前体，而是直接结合Caspase4、Caspase-5、Caspase-11的CARD结构域，进而活化Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。另一处不同的是，Caspase-4、Caspase-5不能直接切割并激活IL-1β、IL-18前体，而依赖于NRLP3、Caspase-1、ASC、K+外流。2015年Schmidbrgk等[13]在Caspase-4介导的人单核细胞焦亡中发现，NLRP3的激活依赖于细胞内K+的外流。同年Yang等[14]发现，细菌LPS诱导的Caspase-11活化可切割缝隙连接蛋白1通道(pannexin-1)，从而导致ATP释放，进而开放膜通道P2X7。在ATP长时、反复刺激下，P2X7可以开放离子通道以促进K+的外流及Na+、Ca2+内流，破坏了细胞膜完整性。同时Pannexin-1通道裂解可以激活K+通道使K+外流，K+的外流再激活NLRP3，NLRP3激活后通过ASC募集激活Caspase-1，活化的Caspase-1再剪切激活IL-1β/18前体，诱导细胞焦亡[15]。2015年Shi等[10]发现，GSDMD同样参与细菌LPS诱导的非经典细胞焦亡，同时发现Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD蛋白，其N端结构域可损伤细胞膜，机制类似于经典途径细胞焦亡。

因此细菌LPS直接结合Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11的CARD结构域并激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11，活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11一方面通过切割Pannexin-1导致ATP释放，激活P2X7膜通道，破坏细胞膜完整性，使细胞内K+外流，激活NLRP3参与到IL-1β的释放及Caspase-1的活化。另一方面活化的Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11可直接切割GSDMD，暴露其N端结构功能域，使细胞膜形成微孔，膜通透性发生改变，细胞肿胀、破裂，诱导细胞焦亡。

3 细胞焦亡与肾脏疾病的关系

3.1 细胞焦亡与缺血再灌注肾损伤 急性肾损伤是一种由多种原因导致的急性肾小管上皮细胞死亡，而肾脏缺血再灌注是导致急性肾损伤的一个主要原因。目前研究发现，除凋亡和坏死等传统的细胞死亡方式外，细胞焦亡在缺血再灌注肾损伤中也起着重要的作用。2013年Yang等[16]在小鼠肾脏缺血再灌注模型中发现，Caspase-1、Caspase-11、IL-1β等焦亡相关蛋白表达增加。在NRK-52E细胞缺氧复氧模型中发现了细胞孔洞的形成及乳酸脱氢酶的释放，进一步研究发现，在缺血再灌注/缺氧复氧发生前，内质网应激的标志物C/EBP同源蛋白(CHOP)表达量增加，以siRNA沉默CHOP基因可显著减少NRK-52E细胞的焦亡，Caspase-11、IL-1β的生成也减少，表明内质网应激参与了缺血再灌注肾小管上皮细胞的焦亡。2016年陈雨等[17]研究发现，缺血再灌注/缺氧复氧上调了肾小管上皮细胞动力相关蛋白1(Drpl)，Drp1过表达使线粒体结构与功能发生改变，从而产生大量活性氧，线粒体来源的活性氧可激活NLRP3及下游焦亡相关因子，导致细胞焦亡，而抑制Drp1的表达可使焦亡细胞明显减少，因此线粒体功能障碍在缺血再灌注损伤细胞焦亡中起着重要的作用。

3.2 细胞焦亡与糖尿病肾病 糖尿病肾病是一种常见的肾脏疾病，是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。细胞焦亡是一种促炎性的细胞死亡方式，其在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用。高血糖状态下机体可生成多种危险相关分子如脂肪酸、活性氧等，可被相关的PRRs所识别，从而启动细胞焦亡[18]。Xue等[19]研究发现，长链非编码RNA MALAT1参与了糖尿病肾病肾小管上皮细胞的焦亡过程。MALAT1抑制了mir-23c的表达，mir-23c的下调促进了其靶基因ELAVL1的表达，ELAVL1是一种细胞焦亡相关蛋白，ELAVL1表达增加后可促进下游NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1的生成，最终导致肾脏炎症反应和细胞焦亡。李嵘等[20]研究发现，mi-497可通过直接靶向抑制NLRP1的表达，从而减少IL-1β、Caspase-1等焦亡相关因子的表达，抑制高糖和胰岛素诱导的系膜细胞焦亡。由此可见，长链非编码RNA及microRNA可调控高糖诱导的肾小管上皮细胞的焦亡，而调控细胞焦亡的其他分子机制仍有待进一步研究。

3.3 细胞焦亡与肾纤维化 肾脏纤维化是多种肾脏疾病进展至ERSD的最终途径。已有研究表明，TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等多种信号通路参与了肾脏纤维化的进展。近年来研究发现，细胞焦亡同样参与了肾脏纤维化的发生发展，Guo等[21]研究发现NLRP3基因敲除的UUO小鼠与野生型相比，其活化的Casapse-1/IL-18/IL-1β明显减少，且肾小球的损伤及小管间质纤维化明显减轻。梁文杰[22]研究发现，化淤解毒中药可通过抑制UUO大鼠NF-κB的激活使NLRP3、IL-18/IL-1β前体生成减少，因而抑制了NLRP3/Caspase-1/IL-18/IL-1β轴的激活。由此可见，细胞焦亡在肾脏纤维化的进展中起着重要的作用，对焦亡通路及调控机制的进一步研究有助于延缓肾脏纤维化进展。

3.4 细胞焦亡与晶体相关性肾病 晶体相关性肾病是指由草酸钙、尿酸结晶等大量沉积于肾小管导致的急性肾损伤、慢性肾脏疾病、肾结石等肾脏疾病。目前研究认为，结晶状物质沉积于肾小管导致肾功能损害主要原因之一是，大量结晶堵塞肾小管导致肾小囊内压增加，肾脏积水等使肾小球滤过率下降，肾脏功能损伤；另外沉积于肾小管的晶体可以激活NLRP3炎性体及下游焦亡相关信号分子，致肾小管上皮细胞焦亡[18]。Mulay等[23]发现，在高草酸钙饮食诱导的急性肾损伤小鼠中，树突状细胞可通过NLRP3/ASC/Caspase-1轴释放IL-1β，而敲除NLRP3/ASC/Caspase-1的基因后，其肾小管损伤和炎症反应有所减轻。Xiao等[24]以含100 μg/mL尿酸培养液培养肾小管上皮细胞发现TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达的增加，予以TLR4的阻滞剂TAK242干预后NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达明显减少，说明尿酸可通过TLR4激活NLRP3及下游焦亡信号因子，导致肾脏炎症反应及细胞焦亡。以上研究表明，干预细胞焦亡通路可减轻晶体相关性肾损伤。

4 结语

细胞焦亡是新发现的一种程序性细胞死亡方式，内源性和外源性刺激因子可通过经典焦亡路径与非经典路径激活焦亡信号通路参与多种肾脏疾病的发生发展，NLRP3、Caspase-1、IL-18/IL-1β是肾脏细胞焦亡路径的关键因子。但目前对于细胞焦亡参与肾脏疾病的相关分子机制及调控机制研究尚较少，对细胞焦亡参与肾脏疾病进行更加深入的研究，有助于进一步揭示其参与肾脏疾病的分子机制，为研发特异性阻断肾脏疾病进展的药物提供理论依据。