正交法优选龟甲胶原料龟甲的炮制提取工艺△

刘艳，张振凌，芦锰，于文娜，李清正

（河南中医药大学，河南 郑州 450008）

龟甲胶为龟科动物乌龟Chinemys reevesii（Gray）的背甲及腹甲经水煎煮、浓缩制成的固体胶，具有滋阴、养血、止血的功能。用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下［1］。龟甲作为制备中药龟甲胶的原材料，其前处理对于龟甲胶的出胶率有着直接的影响。但其原料龟甲从龟甲去腐肉的处理、炮制加工以及煎煮次数的综合研究尚未见具体报道。本研究对龟甲去腐肉净制、炮制方法和煎煮次数对龟甲提取后胶汁中的指标成分L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸含量的影响，采用正交设计法进行工艺优选，旨在对龟甲胶的工艺研究提供一定实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器

Waters2489UV／Visible检测器、Waters1525 Binary高效液相色谱系统输液泵；赛多利斯PB-10酸度计、BS210S型万分之一电子天平（北京赛多利斯有限公司，max210 g，d 0.1 mg）；十万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，max13 g）；KQ-500DV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司，型号：UPT-II-10T）。

1.2 药品

正己烷（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，生产批号：20140321）；异硫氰酸苯酯（含量98%，Aladdin Industrial Corporation）；冰乙酸（天津市富宇精细化工有限公司；批号：20140120）；色谱乙腈 ［Assay（by GC-FID），99.9%］；三乙胺（天津欧博凯化工有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；无水乙酸钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；氨基酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：140624-200805）。

1.3 原料

龟甲经河南中医药大学张振凌教授鉴定为龟科动物乌龟的背甲。

2 方法与结果

2.1 正交设计

试验采用龟甲的净制方法、龟甲的炮制方法、龟甲的煎煮次数作为考察的影响因素，采用L9（34）方法优选龟甲胶煎煮前炮制方法和煎煮次数。见表1。

表1 因素与水平

2.2 操作方法

2.2.1 净制作法 泡：将称好的龟甲置于干净的水池中加入清水，淹没龟甲5～10 cm，每天早晚换水2次，共3 d，用铁刷刷去腐肉。蒸：蒸锅中加水，待水沸，将称好的龟甲置于篦子上，蒸45 min，置于热水中用刷子刷去腐肉。揉搓：将称好的龟甲置于干净的水池中加清水淹没龟甲5～10 cm，每天换水2次，共3 d；将龟甲置于干净的池子中加入适量碳酸钠，不断揉搓去杂质1 h，泡30 min，冲洗40 min。

2.2.2 龟甲炮制的具体操作 砂烫：将砂子炒至流利状态，将洗净的龟甲置于砂子中，不断翻炒，待龟甲表面出现鼓泡状态且颜色呈现黄褐色，出锅，敲碎。砂烫淬：将砂烫过的龟甲投入醋中淬，敲碎。不烫淬：敲碎。

2.2.3 煎煮 上述样品每份均取800 g，置锅内加水2400 mL淹没龟甲，盖上锅盖，按照表中设计煎煮不同的次数，加热煎煮，即煎煮1次者为48 h，煎煮提取两次者为24 h+24 h，煎煮提取三次者为24 h+12 h+12 h。

2.3 龟甲胶胶汁的制备

将上述2.2.3煎煮液分别合并，加热蒸发，均浓缩至2000 mL，得到0.4 g·mL-1的龟甲胶胶汁溶液待测定。

2.4 4种氨基酸含量测定

2.4.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；乙腈-0.1 mol·L-1醋酸钠溶液（用醋酸调节 pH值至6.5）（7∶93）为流动相A，以乙腈-水（4∶1）为流动相 B，梯度洗脱（0～11 min，100%～93%A；11～13.9 min，93% ～88%A；13.9～14 min，88% ～85%A；14～29 min，85%～66%A；29～30 min，66% ～0%A）；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为43℃；进样量为5μL。见图1。

图1 混合对照品溶液和样品溶液的HPLC图

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称定L-羟脯氨酸对照品7.40 mg、甘氨酸对照品14.19 mg、丙氨酸对照品 6.20 mg、L-脯氨酸对照品 7.18 mg于10 mL容量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液制成混合对照品储备溶液，精密量取上述混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、1、2 mL分别置10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至刻度，得到系列浓度的混合对照品溶液。精密量取上述系列浓度的对照品溶液5 mL置25 mL容量瓶中，各加0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL，1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，摇匀，室温放置1 h后，50%乙腈定容至刻度，取10 mL，加正己烷10 mL，振摇，放置10 min，取下层溶液，取续滤液，0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 将浓缩后的胶汁移取2 mL置 25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液20 mL，超声处理30 min，放冷，0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至刻度，摇匀。精密量取2 mL，置5 mL安瓿中，加盐酸2 mL，150℃水解1 h，放冷，移至蒸发皿中，用蒸馏水10 mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解，转移至25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。量取上述溶液5 mL，按2.4.2项下方法 “置25 mL量瓶中，各加0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.4.4 线性关系考察 取2.4.2项下的系列对照品溶液分别进样5μL，在2.4.1项色谱条件下测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，结果见表2。

表2 4种氨基酸的线性关系考察结果

2.4.5 精密度试验 取7号样，按2.4.3项下方法制备，在2.4.1项色谱条件下进样，测得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面积的RSD分别为0.7%、0.4%、1.5%、0.9%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取7号样，按2.4.3项下方法制备，分别在0、3、6、9、12、24 h后按2.4.1项下色谱条件进样，测得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面积RSD分别为0.9%、1.8%、1.1%、1.5%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 取7号样，按2.4.3项下方法平行制备成6份供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样，测得 L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面积 RSD值分别为 1.6%、1.7%、0.9%、2.7%。说明本方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取7号样胶汁1 mL，分别精密加入混合对照品适量，按2.4.3项下方法制备成6份供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样，测得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸加样回收率的平均值为99.71%、99.30%、97.13%、99.29%，RSD值分别为1.28%、2.80%、1.36%、2.08%。

2.5 结果及数据处理

按2.1设计得到的9批样品依照2.4项下的方法制备供试品样品进样，每个样品取平行进样2次，取峰面积积分值得平均值，换算为样品中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸的含量并计算其总和。带入正交表进行结果分析。结果见表3。

表3 龟甲胶胶汁中4种氨基酸含量

表4 正交结果方差分析

方差分析表明，因素A（净制方法）、因素B（炮制加工）、因素 C（煎煮次数）的 F值小于 F0.05（2，2），均未表现出显著影响。直观分析表明，以4种氨基酸的含量总和为指标，净制方法因素中Ⅰ2＞Ⅰ3＞Ⅰ1，炮制加工因素中Ⅱ3＞Ⅱ1＞Ⅱ2，煎煮次数因素中Ⅲ3＞Ⅲ1＞Ⅲ2，得最佳工艺为A2B3C3，即龟甲经蒸制去除腐肉，不烫淬，煎煮3次。

2.6 验证试验

按优化工艺条件，重复3次进行验证试验。验证结果与正交试验结果吻合，表明该工艺稳定可行，重复性好，结果见表5。

表5 验证试验结果%

2.7 方法对比试验

按照优化工艺，对比某厂生产工艺，以及传统生产工艺进行方法对比试验。对比试验结果表明，优选工艺可行。结果见表6。

表6 对比试验结果%

3 讨论

现代研究证明，龟甲胶中主要含各种蛋白质类成分，且2015年版 《中华人民共和国药典》收载龟甲胶的检测方法也选用了4种氨基酸的含量作为指标。故本实验将煎煮的龟甲胶汁浓缩到相同的体积，以4种氨基酸含量总和为指标综合比较不同的处理方法对于龟甲出胶率的影响。

目前龟甲胶的制备工艺并未有明确的规定，系统地研究各种炮制方法对于龟甲出胶量影响的研究并不多见，虽对于去除原材料龟甲上残肉的研究较多，但近年来对于出胶率的研究较少，仅有对于不同季节、不同部位的龟甲胶提取率及含氮量等的研究［2］。龟甲去除腐肉的方法有酶解法、水蒸法、砂烫法、水煮法等多种方法［3-7］。但因为酶解法所需时间较长，且对于环境污染比较严重，因此本研究以传统泡透去腐肉、蒸制刷去腐肉以及弱碱水处理去腐肉法作为因素水平。最终得出蒸制法得到的胶汁中氨基酸总和最高。

在单因素考察过程中，龟甲的煎煮次数的测定结果，L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸的含量在煎煮2次后增加趋势不明显，故本研究将煎煮次数水平选取为1、2、3次。龟甲的煎煮提取程度一般以经验鉴别为主，达到手捏即碎的程度即可［2］。通过煎煮实验预试，认为煎煮48 h的即达到可手捏即碎的程度。依据正交试验结果，龟甲煎煮次数对于氨基酸总量的煎出表现出较大的离散性，离均差平方和明显高于其他两因素，煎煮次数的各水平结果：Ⅲ3＞Ⅲ1＞Ⅲ2，煎煮3次的氨基酸总量和最高。通过验证试验，以及与某厂生产工艺和传统处理工艺的对比，结果显示，龟甲经过蒸制去腐肉，不烫淬，煎煮3次的胶汁中4种氨基酸含量总和达到较高水平，工艺重复性良好，稳定可控，方法简便可行。然而考虑到实际大生产过程中成本的原因，结合实地调研结果，厂家多采用煎煮两次的工艺。因此建议将龟甲煎煮2次后，将龟甲表面之残汁浸泡干净，滤过骨渣的胶汁继续用于下一次生产。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015.

［2］ 万鸣，严宜昌，高欢.不同季节、部位龟甲的龟甲胶提取率与含氮量测定研究［J］.湖北中医杂志，2016，38（3）：71-72.

［3］ 张志国，黄大香，王奇成.龟板两种炮制方法的比较［J］.中药材，1999，22（4）：187-188.

［4］ 赵志华.鳖甲、龟板炮制方法改革［J］.中药材，1993，16（12）：46.

［5］ 陈奇云.两种龟板炮制方法的比较［J］.中成药研究，1986，8（6）：17.

［6］ 陈奇云.两种炮制法对龟板成分影响的对比分析［J］.中药通报，1985，10（8）：24-25.

［7］ 李操元.龟板炮制方法简介［J］.中药通报，1984，9（4）：20.