PAR激活在哮喘发生中作用机制的研究进展

尹艺晓，张发艳，周生余

(1山东中医药大学中医学院，济南250355；2山东大学护理学院)

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等)和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病。近年来我国哮喘的发病率逐年上升，已成为严重威胁居民身体健康和生活质量的公共卫生问题之一。2014年全球哮喘防治创议第一次明确指出，哮喘是一种异质性疾病，其发病机制复杂，至今尚不完全清楚。气道炎症是哮喘最基础的病理改变，气道高反应、可逆性气流受限及气道重塑往往是气道炎症所引起的级联反应。因此，不管是哮喘的急性发作期还是慢性缓解期，控制气道炎症均是治疗的关键。蛋白酶激活受体(PAR)属于G蛋白偶联受体家族成员，被凝血酶、组织因子等激活后，通过G蛋白偶联系统活化PKC等一系列信号转导通路，产生各种细胞因子和炎性介质，继而介导炎症反应。目前，PAR在哮喘气道炎症反应中的作用越来越受到关注。本文结合文献就PAR激活在哮喘发生中作用机制的研究进展作一综述。

1 PAR概述

1991年Vu等首次分离出了PAR，并得到功能性人类凝血酶受体的cDNA，同时对该受体结构和功能进行了阐述。目前认为，PAR是一组具有7个跨膜单位的G蛋白偶联受体超家族，由细胞外N端、3个细胞外袢、7个疏水跨膜区、3个细胞内袢和细胞内C端构成。PAR包括4种亚型，即PAR1、PAR2、PAR3、PAR4，广泛存在于全身各种组织细胞表面。其中，PAR1主要分布于血小板、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经元和星形胶质细胞中；PAR2主要分布于上皮细胞、内皮细胞、成骨细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、神经元、肌细胞和星形胶质细胞中；PAR3和PAR4主要分布于血小板、内皮细胞、星形胶质细胞、肌细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞。

PAR可被多种内源性、外源性蛋白酶和凝血因子等激活。PAR1的配体主要为凝血酶、FⅩa、激活蛋白C、激肽释放酶、颗粒蛋白酶、基质金属蛋白酶等；PAR2配体主要为凝血因子FⅩa、组织因子凝血因子复合物、胰蛋白酶、类胰蛋白酶、肥大细胞纤维蛋白溶酶及凝血酶激活PAR1产生的栓系配体等；PAR3和PAR4配体均为凝血酶。目前认为，PAR有两种激活方式，一种方式需要先形成一个新配体，即凝血酶或其他蛋白酶等配体与细胞外水蛭样结构域结合，裂解其胞外的N末端，释放出一个多肽后，暴露一个新的氨基端，此为新配体，该配体再与受体膜外的第2个胞外袢结合，最终激活PAR；另一种方式为一般受体激活形式，即与栓系配体相对应的PAR激活肽结合，直接激活细胞膜表面的PAR。激活后的PAR通过G蛋白偶联系统，主要是胞内异三聚体或小分子量G蛋白，促进Ca2+释放，活化PKC等信号传导通路，引起信号级联反应，继而影响细胞形态、分泌、代谢和运动等。在呼吸系统中，PAR主要分布于肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和肺肿瘤细胞等。在生理或病理状态下，气道上皮细胞均表达PAR1、PAR2和PAR4，病理状态下尤为明显。激活后的PAR可通过相应信号转导通路介导多种细胞因子释放，参与炎症反应，继而导致肺组织损伤，在炎症性肺疾病中具有重要作用[1]。

2 PAR在哮喘发生中的作用

哮喘是一种以气道高反应性、可逆性气流受限、气道重塑为特征的慢性气道炎症性疾病。气道长期慢性炎症损伤导致的气道上皮纤维化、平滑肌增生肥大等，是哮喘发生、发展及晚期不可逆性改变的病理基础[2]。因此，气道炎症是哮喘最基础的病理改变。气道慢性炎症不仅导致各种凝血因子形成、纤维蛋白沉积和纤溶异常，气道壁水肿而加重气道狭窄，使哮喘症状加重[3]，还可激活PAR，继而影响炎性细胞和细胞因子，最终导致气道重塑[4，5]。

2.1 PAR激活对炎性细胞的影响 目前认为，多种炎性细胞参与了哮喘的发病过程，如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、上皮细胞等。

2.1.1 嗜酸性粒细胞 嗜酸性粒细胞是哮喘气道炎症反应的关键效应细胞，其被激活后能释放许多炎性介质和细胞因子，包括氧自由基、白三烯、白细胞介素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等以及具有细胞毒性的嗜酸性细胞阳离子蛋白、嗜酸性细胞过氧化物酶和主要碱基蛋白等，这些物质均参与炎症反应，继而引起气道上皮损伤，增加气道高反应性[6]。在许多过敏性气道疾病的动物模型中发现，PAR2激活可增加和活化炎性细胞，尤其是嗜酸性粒细胞。在蟑螂提取物诱导的气道高反应小鼠和气道重塑BALB/c小鼠模型中发现，PAR2拮抗剂可显著降低模型小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量和肺组织胶原蛋白成分[7]，而PAR2基因敲除小鼠肺泡内嗜酸性粒细胞和肺泡蛋白漏出液明显减少[8]。对蟑螂蛋白提取物测序分类发现了3种丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶均能够通过PAR2受体激活钙离子和MAPK信号通路[9]。

2.1.2 肥大细胞 肥大细胞属于非特异性免疫细胞，与速发性哮喘的发生关系密切。肥大细胞能驱动过敏反应，激活后脱颗粒释放的类胰蛋白酶能高效诱导中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润,增加气道微血管通透性,刺激气道上皮细胞释放组织胺、白三烯和IL-8等多种生物活性成分和炎性介质。肥大细胞膜上的PAR2激活后可促进IL-18释放，而IL-18又促进肥大细胞聚集和PAR2表达增加[10]。因此，PAR2可间接对肥大细胞产生影响。

2.1.3 上皮细胞 研究发现，上皮细胞也能参与哮喘的发病过程。利用高致敏原链格孢菌滤液作用于人气道上皮细胞，可通过激活PAR2，使体外细胞内钙离子浓度迅速升高和体内炎性细胞募集，而相关拮抗剂可阻断这种反应，提示PAR2可能通过影响炎性细胞而参与过敏性哮喘的发生[11]。

由于PAR2可影响嗜酸性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞和单核细胞等多种细胞功能，诱导哮喘气道炎症的发生、发展。因此，有学者认为单核细胞PAR2表达情况可判断哮喘患者病情，有可能成为哮喘病情评价的生物标志物[12]。

2.2 PAR激活对细胞因子的影响 细胞因子是引起或加重哮喘气道炎症反应的关键因素。目前普遍认为，哮喘是一种Th1型细胞与Th2型细胞失衡的炎症性疾病，Th1型细胞减少、Th2型细胞增加是哮喘发病的一个重要机制。一些过敏原和裂解酶通过激活PAR2，活化呼吸道上皮细胞、肥大细胞、中性粒细胞等使其释放多种细胞因子，引起或加重气道炎症反应。有学者将烟曲霉提取物作用于支气管上皮细胞，通过激活PAR2和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型信号通路，抑制Th1型细胞生成，使Th2型细胞占优势，继而在哮喘发病中发挥重要作用[13]。

2.2.1 促进IL-6、IL-8等炎性介质释放 研究证实，含有蛋白酶提取物的灰尘作用于人类支气管上皮细胞可激活PAR1和PAR2，通过PKC激酶途径促进支气管上皮细胞释放包括IL-6、IL-8、TNF-α及趋化因子CXCL1、CXCL2等多种炎性介质，在气道炎症性疾病中发挥重要作用[14]。IL-6是刺激T、B细胞生长和分化、促进细胞毒性淋巴细胞功能、诱导急性期炎症反应的重要细胞因子；通过促进Th2型细胞比例增加，抑制Th1型细胞分化参与哮喘气道炎症反应过程。作为趋化因子的IL-8主要趋化和激活中性粒细胞，使炎症细胞向气管募集、迁移或浸润，并促进白三烯分泌，继而引起支气管收缩。Jairaman等[15]采用尘螨和蟑螂的提取物刺激支气管上皮细胞，发现至少能部分通过激活PAR2，引起细胞内质网钙释放激活的钙通道调控因子STIM1蛋白和Orai1蛋白活化，钙离子进入细胞后激活钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子(NFAT)信号转导通路，通过NFAT蛋白的脱磷酸化及核内转位，激活下游细胞因子IL-6和IL-8基因的转录。Ramu等[16]采用房屋尘螨、链格孢菌、艾蒿和欧洲白桦四种物质的提取物作用于支气管上皮细胞，发现这些物质可通过激活PAR，剂量依赖性释放ATP和IL-8，而丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制上述过敏原诱导的IL-8 mRNA表达。以上研究表明，不同过敏源均通过PAR激活不同的信号转导通路诱导细胞因子IL-6、IL-8等产生，在哮喘的发病机制中发挥重要作用。

2.2.2 促进单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)释放 研究证实，MCP-1对单核细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞等有趋化和激活作用，并可导致肥大细胞脱颗粒。GM-CSF可刺激髓样单核细胞生长和分化，激活巨噬细胞，刺激嗜酸性粒细胞分化和发育，使嗜酸性粒细胞释放大量白三烯和碱性蛋白，继而损伤呼吸道上皮，加重哮喘症状。Lee等[17]利用表皮尘螨提取液刺激中性粒细胞，发现尘螨提取液可激活PAR2，通过PAR2/PI3K/Akt/ERK/NF-κB信号途径转录表达MCP-1和GM-CSF，但尘螨提取液还具有抗中性粒细胞凋亡作用。因此，PAR及其信号通路是否与中性粒细胞哮喘表型有一定关系尚需进一步研究。

2.2.3 促进TNF-α和IL-18释放 TNF-α亦是一种具有诱导炎症反应和调节免疫反应的重要细胞因子，可作用于血管内皮细胞，诱发IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子释放，促进炎症细胞黏附、游走、浸润及中性粒细胞脱颗粒，导致气道炎症反应加重和气道高反应性。Kim等[18]利用德国蟑螂提取物体外作用于肺泡巨噬细胞，发现PAR2被激活并能刺激细胞释放TNF-α；在哮喘模型小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13水平均升高。IL-18与PAR2激活亦存在相关性。IL-18是与哮喘炎症反应，尤其是肥大细胞募集有关的细胞因子，该细胞因子可诱导巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞浸润，并刺激Th2型细胞因子和IgE产生。在中度和重度哮喘小鼠模型中，IL-18和类胰蛋白酶均明显升高，二者密切相关；类胰蛋白酶能通过肥大细胞上的PAR2促进IL-18释放，而IL-18又可促进IL-4水平升高、肥大细胞聚集和PAR2表达增加[10]。

2.3 PAR激活对气道重塑的影响 研究证实，促炎因子长期持续存在可导致气道平滑肌细胞增殖、细胞外基质沉积，最终出现气道重塑，继而影响肺功能。PAR2激活具有促进支气管平滑肌细胞增殖作用。Allard等[19]对来源于哮喘患者的气道平滑肌细胞给予PAR2激动剂干预，发现细胞增殖能力明显增强，且随着作用时间延长效果更明显；进一步研究发现，这种增殖作用与激活ERK1/2磷酸化通路有关。因平滑肌细胞是气道重塑的关键细胞，由此推测PAR2对气道重塑有一定作用，这可能为今后难治性哮喘的治疗提供了新思路。

目前，关于PAR1对气道重塑影响的研究报道相对较多。人气道平滑肌细胞PAR1被凝血因子Ⅹa激活后，在膜联蛋白A2、整合蛋白和整联蛋白参与下，刺激细胞产生IL-6、细胞周期蛋白D1、纤维生长因子2、血小板源性生长因子B、结缔组织生长因子等，上述细胞因子均参与气道重塑，在哮喘发生、发展中发挥重要作用[20]。PAR1通过促进气道组织TGF-β高表达而加剧气道重塑。TGF-β一直被认为是气道重构的关键因素，不仅能促进气道上皮细胞增生、上皮下胶原沉积和纤维化，还能促使上皮细胞向间质细胞转化。在小鼠哮喘模型气道组织中发现，PAR1 mRNA和蛋白表达明显升高，PAR1激活后通过ERK1/2信号转导通路，使上皮细胞中TGF-β表达升高，并促进上皮细胞向间质细胞转化，导致气道重塑[21，22]。Gong等[23]研究发现，在卵清蛋白诱导的小鼠哮喘模型中，TGF-β使上皮细胞钙黏蛋白向神经钙黏蛋白及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)转化也是通过激活PAR1实现的，而PAR1拮抗剂可恢复上皮细胞钙黏蛋白活性而抑制α-SMA表达，阻止纤维化发生。另有研究发现，哮喘患者气道组织TGF-β和基质金属蛋白酶高表达造成的气道重塑和持续气流受限是重症哮喘或激素治疗效果不佳的一个重要原因[24]。深入研究PAR1、PAR2或其信号通路可能对重症或难治性哮喘的治疗有一定帮助。

综上所述，PAR激活，尤其是PAR2和PAR1激活可通过多种信号转导途径促进炎性细胞和细胞因子大量产生，造成气道慢性炎症反应和气道重塑，引起或加重哮喘。深入研究PAR在哮喘发病机制中的作用及研发PAR阻断剂将有望为哮喘的预防、控制及治疗带来希望。