钩藤活性成分研究进展

刘碧崇， 王 强

(1.成都大学 药学与生物工程学院； 四川 成都 610106； 2.眉山碧丛生物技术有限公司， 四川 成都 620020)

0 引 言

钩藤，茜草科钩藤属藤本植物，是常用的一种中药，主要分布于云南、贵州及广西等地，四川亦有极少量的分布.目前，科研人员对钩藤的研究主要集中于对其药用活性成分提取、分离与鉴定等方面.研究发现，钩藤碱是钩藤最主要的活性成分，具有广泛的药理活性[1-2]，其可通过阻滞交感神经及神经节的过度兴奋，促使外周血管扩张、抑制胞内CA+释放等[3-7]途径对原发性高血压、心血管扩张、动脉粥样硬化以及心律失常常见心血管疾病产生一定的疗效[8-11].虽然钩藤碱的药理活性较为广泛，但因作用较弱的致命缺点，无法以单体化合物成药.

绒毛钩藤，茜草科钩藤属滕蔓生木本植物，为美国中部及南美亚马逊雨林特有的一种热带植物.绒毛钩藤的水溶性提取物(多组分)，是从绒毛钩藤树皮或其他部分提取的水溶性成分.研究显示，绒毛钩藤的水溶性提取物具有抗炎、抗氧化等药理作用，可通过抗炎、抗氧化等机制，增强免疫、增强细胞修复和调节等途径产生抗肿瘤、神经保护、细胞生长调节等功效，进而对多种疾病具有一定的疗效[12-15].

1 神经保护作用

近年来，关于钩藤提取物的神经保护作用的报道较多，研究结果证实，钩藤中具有神经保护作用的物质基础包括钩藤总碱、异钩藤碱等化合物，均具有显著的神经保护作用[16-20]，它们可以通过清除过氧化脂质体及代谢产物、抗氧化、抑制谷氨酸损伤等机制保护细胞、抵抗痴呆[21-23].此外,钩藤水提物、异钩藤碱等成分可以改善Aβ蛋白变性导致的神经细胞损伤[24-25]，可以改善由东莨菪碱激发的记忆障碍模型小鼠的记忆功能;采用70%乙醇进行萃取钩藤得到的复合物，以及单组分异钩藤碱，可以改善D-半乳糖导致的记忆损伤[26-27].例如，黄厚才等[28]的研究结果显示，中药钩藤散制剂具有神经保护作用，保护脑内神经细胞，对老年痴呆模型小鼠产生一定的治疗作用，能提高模型小鼠的脑指数.李超等[29]将钩藤总生物碱与雷帕霉素进行对比研究，结果显示，钩藤总生物碱可以通过多种途径促进自噬小体产生，从而降低细胞因为氧化应激而导致的炎性反应，降低细胞凋亡的比例.

Sandoval等[30]对比了Uncaria tomentosa和Uncaria guianensis的药效差异，在该研究中结合了反向高效液相色谱法、分光光度法测定二者的生物碱、黄酮醇、羟基自由基、脂质过氧化物含量，并采用ELISA法检测TNFα的释放情况，评估了绒毛钩藤和圭亚那钩藤的抗炎活性.在其机理研究中，用TUNEL法和原位RT-PCR技术检测了TNFαmRNA的表达情况，研究结果显示，在抗氧化试验中，绒毛钩藤比圭亚那钩藤更有效.绒毛钩藤具有显著的抗氧化和抗炎活性，并且不受氧化吲哚或五环生物碱的存在的影响.

由于绒毛钩藤提取物具有较强的抗氧化活性，能修复DNA损伤、刺激髓系祖细胞的增殖并引起肿瘤细胞的凋亡.对于正在接受癌症治疗的病人来说中性粒细胞减少是化疗最常见的副作用，绒毛钩藤提取物能刺激健康造血组织细胞增殖，对患者来说具有重要的意义.Farias等[31]研究了绒毛钩藤对不规则细胞生长调节作用发现，绒毛钩藤对粒细胞—巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)以及化疗引起的白细胞减少后中性粒细胞恢复有重要影响，经绒毛钩藤治疗后，患者中性粒细胞计数和效力显著增加，体外试验显示，绒毛钩藤能刺激髓系祖细胞数量显著增加，故将绒毛钩藤用于减少化疗导致的副作用方面具有极大的潜力.Domingues等[32]研究了绒毛钩藤的水—乙醇提取物的免疫调节作用对免疫介导糖尿病的治疗作用.在该研究中，采用HE染色法和免疫组化染色分析胰腺单核细胞浸润情况，并用数字形态测量法测定β细胞胰岛素含量，通过流式细胞仪分析了淋巴细胞免疫表型.研究结果显示，50～400 mg/kg的绒毛钩藤水—乙醇提取物对糖尿病模型小鼠具有显著的治疗作用，模型小鼠的血糖水平显著下降，糖尿病发病率显著降低.胰岛细胞的形态分析显示绒毛钩藤的水—乙醇提取物对胰岛细胞具有明显的保护作用.动物治疗的UT在400 mg/kg提出了更高更完整的胰岛并且对胰岛的破坏有明显的抑制作用.此外，通过免疫组织化学评估，观察到了对β细胞分泌胰岛素的保护作用.表型分析显示，高剂量组(100～400 mg/kg)处理的CD4和CD8+T细胞值与健康动物相似并增加了CD4+CD25+调节性T细胞的数量.绒毛钩藤水溶性提取物可通过不同途径控制免疫介导糖尿病的进展.Maria等[33]评估了绒毛钩藤对缺血性急性肾损伤的肾脏保护作用.结果表明，绒毛钩藤具有显著的肾脏保护作用，具体机制可能与其抗氧化作用有关.

2 镇痛活性研究

结合目前国内外对钩藤等茜草科类植物药用成分的研究结果来看，钩藤提取物中的少量帽柱木碱可直接激活μ-阿片受体(μ-opioid receptors,MORs)发挥镇痛活性[34-35].在上个世纪90年代，科研人员就从钩藤中分离出了帽柱木碱[36-37].帽柱木碱(mitragynine)，最初是从茜草科属植物美丽帽柱木(又名卡痛)叶片中分离得到的生物碱.由于帽柱木碱在钩藤中的含量较低，并未获得足够的重视，导致目前国内少有关于帽柱木碱药理作用的研究报道.而从国外的文献来看，绒毛钩藤中也分离出了帽柱木碱.科研人员对帽柱木碱进行了较为深入的研究，现已明确其作用机理.例如，Kruegel等[34]的研究成果证实，帽柱木碱及部分结构相似的衍生物，能够结合并激活μ阿片受体(μ-opioid receptors,MORs).其中，7-羟基帽柱木碱(7-hydroxymitragynine)的药理活性最强，MOR效力是吗啡的十分之一；帽柱木碱的药理活性比7-羟基帽柱木碱弱，仅为其十分之一.进一步的机理实验表明，帽柱木碱与μ阿片受体(MORs)结合并活化MORs后，激活的信号通路与β-arrestin通路无关.而关于β-arrestin通路的大量研究结果已经证实，β-arrestin通路介导了很多传统阿片受体激动剂的不良反应，例如便秘、呼吸抑制和耐药性.这些研究结果提示我们，帽柱木碱及其衍生物虽然是通过激活μ阿片受体而产生镇痛作用，但其可能不会导致传统的阿片受体激动剂所造成的便秘、呼吸抑制和耐药性.7-羟基帽柱木碱似乎可以代替吗啡用于某些较为轻微的疼痛.此外，在光照和氧化条件下，溶液中的帽柱木碱有几乎一半通过氧化反应，转化为7-hydroxymitragynine.由于帽柱木碱的稳定性极差，即便在光照条件下，大约8%的帽柱木碱会转化为7-羟基帽柱木碱.Takayama等[35]利用豚鼠离体回肠试验对帽柱木碱及其衍生物的药理学活性实验结果显示，帽柱木碱的镇痛活性具有显著的浓度依耐性.小鼠脑侧室注射给药甩尾实验结果显示，帽柱木碱具有显著的镇痛活性，但活性明显弱于吗啡.

此外，刘碧崇等[38-39]研究表明，钩藤提取物具有一定的镇痛作用，但尚不清楚具体成分.但钩藤水提物可通过抑制中性内肽酶降解内啡肽，产生一定的镇痛作用.

虽然帽柱木碱的镇痛活性已经明确，但其机制与抑制脑啡肽酶水解内啡肽的机制不一致，存在多种可能性.钩藤水溶性提取物中的镇痛活性成分的分离、鉴定等后续研究工作中，首要任务仍然是对活性成分的分离鉴定.完成相关的成分的鉴定后，可结合国内外现有研究成果，缩小研究范围.需要注意的是，应尽可能的对一些含量较低或未进行充分研究的成分进行药理活性研究，避免漏掉关键活性成分.

3 讨 论

从目前的相关文献报道来看，钩藤的提取工艺因为研究目的不同而呈现出一定的差异[37].以化合物的分离鉴定为目的研究，多以乙醇水溶液提取钩藤总碱，而后进一步采用氯仿、乙酸乙酯等溶剂进行梯度洗脱的方式可提取、分离出多种生物碱类.将乙醇水溶液提取后酸化处理(pH值至2～3)后的不溶性成分用乙酸乙酯进行萃取可得非生物碱类成分，再经石油醚—醋酸乙酯梯度洗脱，可分离得到多种非生物碱类成分.

自钩藤中提取分离帽柱木碱，可采用以下工艺：将粉碎后的钩藤粉末用95%乙醇常温浸提数次，合并提取液后，浓缩得到浸膏.向浸膏中加入一定浓度的盐酸充分溶解，并将溶液pH值调整至2～3，抽滤得到滤液和酸不溶性成分.逐滴加入氨水，调整溶液pH，以氯仿—乙酸乙酯混合物梯度洗脱，将组分再经RP-18反相柱色谱洗脱即可分离到帽柱木碱.

钩藤的成分较为复杂[40]，因此针对不同的成分的提取需要采取不同的方法.目前，对钩藤药用成分的提取方法主要有两种：一种是用乙醇提取后，采用乙酸乙酯等脂溶性成分进行萃取，该方法提取得到的成分主要是脂溶性物质，例如钩藤碱等；另一种是采用乙醇等成分进行提取，然后用乙醇进行萃取，该方法得到的是水溶性成分.国内对钩藤碱、异钩藤碱等成分研究得比较深入，相应的钩藤碱、异钩藤碱等成分的提取方法较为成熟.国外对绒毛钩藤的药用成分的研究多采用水—乙醇结合的方式进行提取，再结合超滤等技术除去大分子物质(鞣质、黄酮等).传统中药在应用过程中，多进行水煎，与国外的提取方法更为接近.

综上所述，由于钩藤活性成分具有广泛的药理活性，包括降血压、心血管保护作用、神经保护作用等.因此，钩藤水溶性提取成分所体现出来的镇痛作用，其究竟是由多种活性成分共同作用导致的，还是由某种含量较低的成分(活性较强)所介导的，在后续工作中，需要进行大量深入细致的研究，才能进行确证.同时，由于钩藤成分复杂，故而成熟、稳定的水溶性成分提取方法或许是能否成功分离出镇痛活性成分的关键所在.