浓缩血小板产品在创伤外科应用中的问题与思考

程 飚

创伤始终伴随人类社会的发展过程，创伤外科的治疗概念也始终在不断的发展和进步，再生医学给创伤外科的组织或器官理想修复带来无限的遐想。当前再生医学的研究热点多集中在干细胞、组织工程等方面，作为再生医学构成的重要部分——生物活性因子，理应受到更大的关注，它不仅直接参与(干)细胞增殖、迁移、分化活动，并与组织工程材料血管化、微环境紧密相关。生物活性因子种类繁多，目前临床上使用的人工合成生物活性因子多仅限于外用，体内应用的安全性尚无定论，且生物效应单一，缺乏“综合”、“瀑布式”的效果。体内本身存在一种可释放多种生物学活性物质的细胞——血小板，当其浓缩后再活化所产生的多重生物学效用更加显著，越来越受到创伤组织与再生领域学者们的青睐与关注[1]。

血小板作为一种分泌型细胞，平时处于休眠状态，当组织受损后，其首先在损伤部位发生聚集，随后形态改变，通过胞吐方式释放颗粒，包含多种活性物质。既往人们关注的是血小板在血栓和止血中的作用。近些年来研究发现，除传统的止凝血作用，血小板释放的活性物质还参与体内组织损伤修复和再生的过程。特别是集中在生长因子方面，主要包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor,PDGF)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-likegrowth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等。随着人们对血小板在组织修复中所扮角色的深入认识，事实上发现，它可分泌十几类上百种的活性分子，如趋化因子(chemokines)、细胞因子(cytokines)、细胞骨架蛋白(cytoskeletal proteins)、氧化应激酶(如NADPH)等，甚至凋亡蛋白。这些产物激活炎症细胞(巨噬细胞等)、血管内皮细胞、间充质干细胞和成纤维细胞等，不仅促进坏死组织的降解和移除，而且参与新生组织的再生调控[2]。而血小板体外浓缩后再应用时以上这些作用更加显著[1]。

1 有关浓缩血小板的命名与定义

目前有关浓缩血小板的命名纷繁复杂[3]，较为流行的如富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)和富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin,PRF)，甚至被人为的定义为一代、二代产品。另外，还有浓缩生长因子(concentrate growth factors，CGF)、富血小板浓缩液(platelet-rich concentrate,PRC)、浓缩的富血小板血浆(concentrated platelet-rich plasma,cPRP)、富集血小板血浆(platelet-enriched plasma,PeRP)、血小板胶(platelet gel， PG)、血小板释放生长因子(platelet-released growth factors,PRGF)、富含生长因子的血浆(plasma rich in growth factors,PRGF)、改进型PRF(advanced PRF,A-PRF)、含白细胞的富血小板血浆或纤维蛋白(leukocyte- and platelet-rich plasma/fibrin,L-PRP/L-PRF)(leucocyte-platelet-rich)、纯富血小板血浆或纤维蛋白(pure platelet-rich plasma /fibrin,P-PRP/ P-PRF)。诸多的称谓不利于浓缩血小板在临床上广泛、合理和科学使用。

首先，各类浓缩血小板产品所含生物活性成分(特别是生长因子)的浓度相差几倍甚至更高。PRP最早出现在1965年，当时关注的是血小板吞噬与聚合作用。因此，PRP的定义依然停留在20世纪60年代，将超过血液中血小板均值3～5倍的浓缩血小板称为PRP，更有人将其设定为6～8倍。应该说，伴随浓缩血小板浓度、活性与功能关系的深入认识，这一概念明显滞后，也不够严谨。诸多研究显示，不同浓度血小板在不同细胞和组织中的作用迥异。当前所用浓缩血小板产品应该是单位体积(每mL)条件下，功能完备的血小板数量(number of platelets/mL)≥106才能发挥强大的组织修复与再生作用。浓度只是众多问题中的一部分。

另一方面，不同的制备方法得到的浓缩血小板产品所包含的活性成分和生物学效用大相径庭。所涉及的不仅仅是所含生物活性产物构成比，且立体的分子构象千差万别，发挥的生物学作用也各有千秋[4]。传统的PRP血浆成分中的纤维素、纤连蛋白及粘连蛋白是良好的细胞黏附分子，可作为生长因子的载体应用于某些特定类型损伤的修复。而PRF与传统的PRP四分子结构不同，多经过缓慢自然聚合，产生纤维蛋白为三分子立体网状结构，其凝胶组织较为疏松、孔隙大、弹性高，有利于组织细胞及循环血中的干细胞快速长入，细胞/生长因子被大量的滞留，并与纤维蛋白发生化学键结合。PRF的纤维蛋白构成(干)细胞附着、迁移，以及分化提供所需的微环境，并能充分发挥多因子间的协同作用。PRF纤维蛋白基质内所含免疫细胞的数量调控炎症反应。CGF则富含红细胞、血小板以及铁、钙和其他基本元素，多制备1～2mm的微粒用于组织受损后的缺损与腔隙，起着充填、支撑作用，也可用于粘合伤口。在组织工程中，CGF可加速移植生物材料的融合与重塑，减少感染机会，其独特的三维结构充分发挥所含生长/细胞因子的协同效用，纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物可促进中性粒细胞的迁移，并参与噬菌、免疫调控和酶降解过程。同时，在组织损伤时，不仅引导损伤组织的再血管化、免疫调控，还能捕获循环血中的干细胞，参与组织修复与再生，甚至与其他生物材料混合后，参与组织损伤后再生微环境的构成。

随着对影响浓缩血小板产品中血小板数量因素、活化后成分构成差异、空间构造和不同功能认识的深入，以及其应用范围和模式不断拓展与改变，对浓缩血小板治疗技术应有全面创新性的思考。以往众多的命名各有特点，但都离不开“浓缩”“富集”的基础，针对不同组织(骨、软骨、肌肉、脂肪、皮肤等)、不同目的(增殖、迁移、促分化、充填/支架、血管化、吞噬、氧化-还原应激)可能需要不同形式的浓缩血小板，因此称之为浓缩血小板治疗(enriched platelet therapy or enriched platelet treatment,EPT)技术更为合理[5]。作为这项治疗技术，PRP、PRF、浓缩生长因子(CGT)等都是它的内涵，且可根据组织损伤后修复所需启动的信号通路和关键蛋白，选择合适形式的浓缩血小板产品(是否含中性粒细胞或淋巴，是否外源或体内激活等)，对进一步丰富治疗手段，提高临床治疗效果具有重大意义。

2 创伤外科应用中浓缩血小板可能涉及的机制

骨组织损伤后，浓缩血小板中的多种生长因子具有促骨干细胞的增殖，以及间充质干细胞的迁移与转化；增加Ⅰ、Ⅲ胶原表达，促进骨骼系统再生[6]。同时，浓缩血小板血浆凝胶结构为大量的纤维交织，其所形成的支架含大量孔隙，且彼此相通，孔径为200～1 000μm，孔隙率80%，对于制备骨的组织工程支架材料十分有益。软骨组织受损后，自身再生修复能力极弱[7]。浓缩血小板所含丰富的生长因子及其组织再生的“必备因子”，可为软骨细胞生存提供良好微环境，促进软骨再生[8]，甚至对椎间盘的损伤后再生有较好的作用。肌肉组织受损后，不同浓缩血小板产品(PRP和PRF)可促进肌肉干细胞增殖分化，维持其多能性；募集、激活和动员卫星细胞和巨噬细胞，促进成肌细胞分化及血管生成，加速损伤部位愈合，并提高收缩强度，加速肌肉恢复，并在胶原降解沉积过程中发挥作用[9]。浓缩血小板治疗肌腱损伤的机制可能涉及通过氧化应激产生短暂的炎症反应、启动再生信号通路；刺激肌腱细胞外基质分子基因表达，直接促进肌腱细胞分化和血管生成；激活并募集外周循环来源的干细胞；增强血管化和代谢活性；促进干细胞向肌腱细胞的分化并增强肌腱组织生物力学性能。但肌腱修复所需最佳血小板浓度和白细胞组分参与与否尚无明确定论，不同临床试验的结果迥异[10]。神经组织损伤后，浓缩血小板具有提高神经特异性烯醇和膜相关蛋白-2、神经细胞黏附分子、突触蛋白的作用，可促进脂肪干细胞向神经分化；血浆及细胞因子和多种蛋白质可营养神经；直接促进雪旺氏细胞增殖，促进其分泌神经营养因子和胶质细胞营养因子，加速神经修复；一些生长因子可直接促进轴突生长与再生、大脑皮质和脊髓生长[11]。当皮肤损伤后，浓缩血小板释放的多种蛋白质可调节炎症反应，促进伤口修复启动、皮肤成纤维细胞增殖与分化、肉芽组织增生、伤口收缩、血管增殖与迁移，有助于新血管生成；提高胶蛋白和纤连蛋白表达，抑制细胞外基质降解，激活大量的纤维蛋白构成皮肤支架，是维持细胞增殖生长的必要条件；促进角质形成细胞周期蛋白和周期素依赖蛋白激酶表达，加速再上皮化，具有一定的抗感染能力[12]；甚至有希望利用浓缩血小板将皮肤的修复向完美再生过渡，生成的皮肤不仅仅是覆盖的结构，而且有分泌和代谢(汗腺、皮脂腺等)的功能[13]。

特别要提出的是其对神经的作用不仅仅表现在对促进神经自身的修复与再生，而且能降低受损组织的神经过度兴奋，控制与恢复受损区域神经轴突再生，使受损靶器官(骨、软组织等)接受神经再支配，调控这些组织损伤后的修复再生过程[14]。而新血管形成是所有组织损伤后修复、组织工程再血管化以及再生医学的必要步骤。所有组织损伤时，血管内皮细胞都会诱发血小板的聚集与活化，启动后续一系列生物学活动。浓缩血小板通过释放各种促血管形成的生长因子(PDGF、VEGF、bFGF等)和细胞因子(IL-8、IL-3、αvβ3-integrin 212等)，以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)，相互协调完成新血管形成。机制包括：促使血管基膜降解，内皮细胞增殖和迁移，血管腔形成，基膜重排以及外周或血管平滑肌细胞募集，周细胞的增殖、迁移，血管壁成熟。构成新血管形成所需的微环境，募集和调控间充质干细胞。在组织工程材料方面，浓缩的血小板具有促间充质干细胞增殖但不引起分化的优势[15]。

以上资料显示，在组织损伤修复中，浓缩血小板发挥作用的机制可能包括：杀菌、调节炎症细胞，启动免疫反应；调控修复(干)细胞的增殖、分化和迁移，以及凋亡过程；维持毛细血管上皮细胞完整性、有助于新血管形成；调控干细胞再生微环境、改变组织修复信号蛋白的浓度，影响信号通路转导。因此，适用于所有创伤外科领域，如矫形外科、运动医学、神经外科、心胸外科、泌尿外科、口腔颌面外科、耳鼻喉、眼科、整形美容外科[16]，尤其是当前热门的组织工程和再生医学。

3 浓缩血小板产品的标准化问题

浓缩血小板产品表现出的越来越多生理功能，在各创伤领域也表现出一大批可喜的治疗结果。但有部分临床试验显示，运用浓缩血小板产品修复组织缺损的作用并不显著。既然血小板是一种分泌型细胞，那么其应用属于生物细胞治疗的一部分，这就存在所有细胞治疗所面临的共同问题，即标准化。每一次浓缩血小板产品的制备条件都会影响血小板的活化与功能[17]。可能的原因包括：所有血小板浓缩产品中活性物质(包括生长因子、黏附分子、趋化因子等)含量的多少取决于其在血小板活化时的释放情况。涉及研究人员及临床工作者制备标准(离心速度、时间)、提取、纯化技术的差异，以及所导致不同的血小板浓度比和血小板活化及碎裂程度的客观因素(温度、耗材等)。另外，特殊人群(年龄、贫血、代谢性疾病等)、服用药物(阿司匹林等)情况对血小板功能本身有影响，其浓缩后的生物学效用差别极大[18]，如浓缩血小板激活产生大量的纤维蛋白支架的硬度与血小板数量非线性关系，且对间充质干细胞的生物学行为产生不同的影响。

即使限定血小板在血浆中的相对数量，也会由于生理周期的变化、制备条件导致浓缩血小板所含活性物质的差异。另外，白细胞所占比例、血小板活化时释放的细胞外囊泡(extracellular vesicleis,EV)情况、各类生长因子含量的构成比，以及其他很多活性成分(如thrombin)都影响着最终参与修复时启动信号通路和活化蛋白的差异。各类修复细胞对不同浓度和质量血小板的反应并不相同。选择性激活浓缩血小板达到对修复组织的要求，即构建合理的微环境十分必要。更为关键的是，目前并不知道EPT完整作用的分子机制。对于浓缩血小板注射应用时可能会导致局部组织的炎症，如何减少或合理控制尚待进一步探讨。因此，致力于浓缩血小板研究的学者们应尽早制定一份关于EPT临床使用的专家共识或指南，规范浓缩血小板产品的制备、储存与转运，不同组织使用和治疗时的质控标准，并不断在深入研究中完善。国际和国内相关机构当前应加快进行一些关键质控指标的指导与限定，但由于涉及领域多，既是优势也是弊病，同一材料不可能满足不同组织修复的需求。这将是今后一个时期，这项治疗手段面临的重要问题之一。

4 展望

创伤外科应用浓缩血小板产品的优势有：(1)自源性，避免外源性生长因子的免疫排斥和疾病传染风险；(2)制备简便、快捷、方法成熟，目前市场上有多种仪器和套装；(3)含多种高浓度生长因子协同作用，弥补单一因子不足；(4)根据促生长、充填、支架需要，可选择不同的浓缩血小板形式；(5)制备对患者损伤小，只需从周围取血即可；(6)具有抗菌能力，多种成分发挥抗菌活性；(7)能够对包括血管神经在内的多种组织同步修复，符合机体的生理需求。特别是近年提出在损伤组织的再生医学应用，避免生物合成多肽应用中安全性的顾虑。对于当前创伤外科越来越多地使用生物材料(关节、骨水泥、壳聚糖、钛网、硅胶等)，加用浓缩血小板在防止植入物发生细菌生物膜、引发感染，减少手术失败方面是有益的[19]。

浓缩血小板在体内还是体外激活对修复细胞的生物学行为影响很大，如近年来外泌体(exosome)的研究如火如荼。已有研究表明，血小板活化后所分泌的细胞外囊泡能释放两种微粒，一种是直径>100nm的多囊泡体(MVBs)和α颗粒，另外一种则是由多囊泡体和α颗粒进一步激活后释放的直径40～100nm外泌体，这些细胞外囊泡对释放生长因子、炎症因子、黏附蛋白、信号通路蛋白、micrRNA等成分的构成比对浓缩血小板的功能产生巨大影响，进而对细胞迁移和增殖、加速血管新生、调控细胞凋亡和存活，以及细胞间信号交互发生改变，显示出组织修复和再生过程中各自独特的生物学作用[20]。随着外泌体在再生医学的研究逐渐深入，将外泌体某些指标作为浓缩血小板细胞治疗的指标，或许是解决细胞移植标准，使之科学、合理应用于再生修复领域的重要途径。另外新近研究表明，浓缩血小板影响周围血单核细胞和树枝状细胞的分化，其免疫调控反应对再生微环境的影响在组织损伤后的修复过程中不可忽视，甚至对修复结局的影响举足轻重[21-22]。血小板的抗炎和抗菌肽[23]作用可能对当前研究热点——“微生物区(microbiota)”产生影响，微生物区可以干预修复进程[24-25]。新的激活方式(如超声波、脉冲电场等)是否会提高浓缩血小板的活性产物释放，满足不同层及组织修复的需要，达到理想的治疗效果值得探索[26]。而与新型生物材料联合使用可能对浓缩血小板在创伤修复更广阔范围使用中有巨大的推动作用[27]。

总之，剂量(不同的修复组织或细胞)、时间(受损时间)、形式(是否激活、是否混合炎症细胞、注射或外用)，以及在构建组织工程进行创伤修复与再生时所需的最佳微环境浓度均是未来要关注的重点。在提倡精准医学(治疗)的今天，如何为创伤组织定制一个有益的浓缩血小板产品还需要进行大量的基础研究和临床验证。