奶牛脐带间充质干细胞介导PI3K/Akt/mTOR信号通路对乳腺上皮细胞凋亡调控研究

王立文，余 雄，赵艳坤，李 杨，邵 伟

（新疆农业大学动物科学学院，新疆肉乳用草食动物营养实验室，新疆乌鲁木齐 830052）

本课题组研究发现，将间充质干细胞应用到畜牧生产能够显著促进动物体的生长发育，提高机体免疫能力[1]，可修复乳腺炎模型大鼠的乳腺组织，促进乳腺组织形态发育[2]，具有非常重要的作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路是机体内一条重要的信号通路，参与多种细胞生物学过程，包括转录、翻译、代谢、血管生成、细胞周期以及细胞增殖、凋亡等，由于具有多种生物学作用，已经被应用到生理学、细胞学、临床医学、生物化学、组织遗传学等方面并取得了一定的进展[3]。研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路是调节细胞增殖、分化和调亡的重要信号转导通路。AKT可调控多个与细胞凋亡有关的家族从而抑制细胞凋亡[4]，例如可抑制Forkhead家族转录因子的活性，下调Fas/FasL诱导的凋亡过程；抑制前凋亡蛋白BAD及caspase-9的活性，阻止其促凋亡作用[5]。间充质干细胞能够通过自分泌和旁分泌作用分泌一些细胞因子，作用于一些相关的受体，可将质膜上PIP2磷酸化为PIP3，从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路[6]。研究发现，IGF-1等生长因子可激活 PI3K/Akt信号，下游效应蛋白mTORC1 / S6K1 能促进成骨细胞分化[7]，并抑制其凋亡[8]。

目前认为PI3K/Akt/mTOR信号通路的上游刺激因子主要有4类，即生长因子与胰岛素、营养因子、能量以及压力[9]。众所周知，脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs）可以分泌多种细胞活性因子，这些因子可以激活相关信号通路参与细胞生活动的调控。本研究首次利用UC-MSCs独特的生物学特性，研究是否可以通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控乳腺上皮细胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells，BMECs）的凋亡，为在细胞和分子水平上寻求泌乳生物学与乳腺功能调控的新方法、新途径奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源 奶牛UC-MSCs来自于本实验室培养鉴定的荷斯坦奶牛[10]，奶牛BMECs购自于广州吉尼欧公司（MEC，GZ/JNO-2015）。

1.1.2 主要仪器和试剂 台式低速离心机（湘仪，TD5A-WS）；流式细胞仪（美国BD，Becton Dickinson Facscalibour）； 倒 置 显 微 镜（ 日 本，Motic-AE31）；洁净工作台（上海博讯，SW-CJ-1F）；二氧化碳培养箱（上海博讯，HF151UV）；H-DMEM、胎牛血清（美国，Gibco）；MTT、0.01% PBS、0.25%胰蛋白酶+EDTA（美国，Hyclone）；LY294002、Ra-Pamycin（美国，Gene Operation）；FITC-Annexin V（宝灵曼公司）。

1.2 实验分组及设计 将复苏后的P3代生长状态良好的BMECs细胞和培养至 P3 代的UC-MSCs分别按照1:2的比例接种于培养瓶内培养，细胞总数为1×106/瓶，设单纯 UC-MSCs和单纯BMECs对照组，细胞总数为1×106/瓶。将BMECs细胞分别接种于4个培养瓶中，每个培养瓶接种6.7×105个细胞，随机选取其中2个培养瓶，在培养液中加入LY294002（50 µmol/mL），另外2个培养液内加入RAPA（50 nmol/mL），作用48 h，倒掉4个培养瓶内的培养液，用PBS冲洗2次，然后随机选取1个加入LY294002的培养瓶和1个加入RAPA的培养瓶，分别接种3.3×105个UCMSCs，4个培养瓶内均加入5 mL完全培养基。7个试验组分别为UC-MSCs组、BMECs组、共培养组、BMECs+LY294002组、BMECs+RAPA组、 共 培 养+LY294002组、共培养+RAPA组。均放置于37℃、5%CO2细胞培养箱内常规培养。

1.3 细胞凋亡检测 悬浮细胞直接收集到10 mL的离心管中，每样本细胞数为（1～5）×106/mL，500～1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，500～1 000 r/min离心5 min，用100 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育 10～15 min，500～1 000 r/min 离心5 min 沉淀细胞孵育缓冲液洗1次，加入荧光（SAFLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动，流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。

1.4 统计分析 实验数据以平均值±标准差表示，使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，用Duncan's进行多重比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路对BMECs凋亡的调控作用 应用Annexin V/PI双染法联合流式细胞仪检测各组细胞在72 h时的凋亡情况（每个试验组重复3次，取平均值）。如表1所示，BMECS+LY294002组和BMECS+RAPA组的细胞凋亡率极显著高于BMECs组（P＜0.01），说明当抑制剂阻断 PI3K/Akt/mTOR信号通路时BMECs细胞凋亡率增加。

表1 抑制剂对BMECs凋亡的影响（n=3） %

2.2 UC-MSCs对PI3K/Akt/mTOR信号通路调控BMECs的影响 如表2所示，BMECs+LY294002组和BMECs+RAPA组的细胞凋亡率极显著高于BMECs组和共培养组（P＜0.01）；BMECs+LY294002组的细胞凋亡率极显著高于共培养+LY294002组（P＜0.01）；BMECs+RAPA组的细胞凋亡率极显著高于共培养+RAPA组（P＜0.01），说明与UC-MSCs共培养能够降低抑制剂对BMECs凋亡的影响。

表2 Annexin V/PI双染法检测各组细胞凋亡率（n=3） %

应用Annexin V/PI双染法联合流式细胞仪检测各组细胞在72 h时的凋亡结果显示（图1），细胞分群明显，明显分开于4个象限中，说明用Annexin V/PI双染法联合流式细胞仪检测各组细胞在72 h时的凋亡情况操作正确，结果可靠。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

3 讨 论

3.1 UC-MSCs和BMECs共培养抑制BMECs凋亡 在本实验中，将UC-MSCs和BMECs按照 1:2 浓度比混合共培养后，能够明显抑制BMECs细胞凋亡，说明UC-MSCs和BMECs共培养能够抑制BMECs凋亡。研究表明，细胞凋亡普遍存在于机体细胞中，受多种因素调控，如激素和生长因子失衡，高温、强酸、强碱等理化因素，抗癌药物，免疫性因素，细菌、病毒等微生物学因素[11]。凋亡的抑制因素包括IL-2、神经生长因子等细胞因子、某些激素、某些二价金属阳离子、药物等[12]。研究表明，UC-MSCs能够抑制肿瘤坏死因子的分泌，而肿瘤坏死因子能诱导某些正常细胞凋亡，当机体处于炎症等多种病理状态下，体内肿瘤坏死因子合成和分泌增加，诱导细胞凋亡[13]。本实验结果表明，与UC-MSCs共培养能够抑制BMECs细胞凋亡，推测主要原因为UC-MSCs抑制了肿瘤坏死因子等促进细胞凋亡的生长因子的分泌，后期将进一步实验证实。

3.2 UC-MSCs细胞通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制BMECs凋亡 本实验中，将UC-MSCs和BMECs按照1:2的比例共培养，能够抑制BMECs凋亡，但其作用机制尚不明确。为探究UC-MSCs抑制BMECs凋亡的具体机制，探讨了PI3K/Akt/mTOR信号通路在其中所发挥作用。PI3K和Akt是抗细胞凋亡作用的重要调节因子，在调节多种细胞增殖、抑制细胞凋亡中发挥作用[14]。PI3K被激活后，可把底物PIP2转化为PIP3，PIP3作为第二信使激活信号通路下游的众多信号分子，可参与细胞的增殖、分化凋亡、存活和迁移等的信号传递[15]。Akt可调控多个与细胞凋亡有关的家族从而抑制细胞凋亡，例如可抑制Forkhead家族转录因子的活性，下调Fas/FasL诱导的凋亡过程[16]；抑制前凋亡蛋白BAD及caspase-9的活性，阻止其促凋亡作用[17]；正调节转录核因子NF-κB和bcl-2，从而抑制细胞凋亡[18]；上调IAPs（Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs）的表达，发挥其抑凋亡作用[19]；也能通过磷酸化mTOR及其下游分子p70S6K、4E-BP1下传生存信号，抑制不依赖p53的细胞凋亡，促进细胞生存[20]。因此，可以推测UC-MSCs可能通过旁分泌和自分泌作用分泌的细胞因子，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而调控BMECs的凋亡。而PI3K和mTOR属于PI3K/Akt/mTOR信号通路上、下游信号分子，为了验证上述推测，本实验设计用PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAPA孵育细胞，发现加入抑制剂LY294002和RAPA后，BMECs组凋亡率均显著高于抑制剂处理前，说明PI3K/Akt/mTOR可能参与BMECs凋亡的抑制调控过程。值得一提的是，BMECs与UCMSCs共培养再加入PI3K抑制剂LY294002后凋亡率降低到5.79%，加入mTOR抑制剂RAPA的组凋亡率降低到5.87%，说明UC-MSCs不仅能够激活PI3K，活化下游信号通路，同时能够重新活化mTOR，即UCMSCs能够再次激活被阻断的PI3K/Akt/mTOR信号通路，或者可以说，UC-MSCs能够“修复”PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制BMECs凋亡，使其重新参与到细胞的正常生命活动中去。

4 结 论

将UC-MSCs和BMECs按照1:2浓度比混合共培养，能够抑制BMECs细胞凋亡，PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAPA孵育BMECs显著提高了BMECs细胞凋亡率，与UC-MSCs共培养能够消减抑制作用。

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