血清差异多肽检测技术及其在女性生殖系统恶性肿瘤早期诊断中的应用现状

张金玲，李岩

(1 暨南大学附属第二临床医学院，广东深圳518000；2 北京生物物理研究所)

近年来，随着医疗技术的不断发展，越来越多的研究者致力于寻找理想的肿瘤标志物，以期实现肿瘤的早期诊断。目前尚未发现诊断女性生殖系统恶性肿瘤敏感性和特异性均较高的专属肿瘤标志物。多肽组学是蛋白质组学的一个分支，近年来受到越来越多的关注，逐渐成为各领域研究的热点。组织内的一些蛋白质降解后的多肽片段，可通过某种途径进入血液循环，在机体生理和病理生理过程中发挥重要作用[1]，如内分泌调节、营养物质传递、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等。血清差异多肽谱是通过检测血液中差异多肽片段所获得的图谱，可用于寻找某些疾病在血液中的潜在分子标志物，并用于疾病的筛查和诊断[2]。本文就血清差异多肽谱在宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌早期诊断中的应用进展作一综述。

1 血清差异多肽及其检测技术

1.1 血清差异多肽的作用 多肽通常是指分子量不超过10 kD的小分子量蛋白，由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物为二肽，由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物称为多肽。多肽在人体内具有不可替代的调节作用，几乎涉及到人体的所有生理活动，被喻为人体内的“信息使者”“体内战场的指挥官”。人体体液均可作为获取多肽的来源，以血清中多肽最容易获得。血清中小分子多肽片段可参与部分疾病的病理生理过程，为发现疾病的发生、发展规律提供重要的科学依据。在健康人群和肿瘤患者的血清中寻找差异多肽，从而建立血清差异多肽谱，可为肿瘤的早期诊断、病情程度评估等提供依据[3]。目前已发现的与肿瘤相关的差异多肽，有的是具有生理功能的多肽分子，如铁调素、补体C3f片段等[4]，有的是高丰度蛋白降解片段[5，6]。这些差异多肽可反映其母蛋白含量变化，也能体现与其产生相关的蛋白酶含量变化。

1.2 血清差异多肽检测技术 血清中高丰度、高分子量的蛋白质，如清蛋白、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白等占总蛋白质的99%以上，这些蛋白会严重干扰血清多肽检测[7]，常规检测手段无法排除这些蛋白质的干扰。根据多肽与高分子量蛋白质的极性、电荷、溶解度及分子尺寸等特性不同，研究者建立了多种多肽分离方法，如反相色谱法、离子交换色谱法、有机溶剂沉淀法、超滤法等以及纳米芯片技术等[8]。目前检测血清多肽效果最好的技术是纳米芯片富集多肽结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术。纳米多肽芯片是集现代生物技术、信息技术、微电子技术和微机电技术为一体的高新技术芯片，主要是通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对机体的生物组分进行准确快速的富集前处理过程，其在硅片上合成一层约700 nm厚、孔径3 nm左右的多孔硅结构膜，可对血清中的多肽组分进行有效富集[9]。MALDI能通过检测待测样品中不同成分的分子量及离子强度来展示待测样品的特征，具有敏感性高、特异性强、质量检测范围广、使用简单快捷等优点。这两种新型生物技术有机结合，即MALDI-TOF-MS技术，可检测大量多肽和小分子蛋白质的混合样本，在识别生物反应机制和细胞途径状况的复杂蛋白质组图谱方面效果显著。目前，该技术已成功用于多种荷瘤小鼠以及人体样本的生物和临床检测中[10～14]。

2 血清差异多肽谱在生殖系统恶性肿瘤早期诊断中的应用

2.1 血清差异多肽谱在宫颈癌中的应用 人乳头瘤病毒(HPV)感染，尤其是高危HPV持续感染是宫颈癌的致病因素。目前，已将HPV检测广泛用于宫颈癌筛查，其敏感性虽高，但特异性差，仅能作为初筛手段，对于宫颈癌的诊断、预后评估等仍需根据临床病理结果。随着肿瘤分子生物学的研究进展，运用血清差异多肽检测技术建立宫颈癌的血清差异多肽谱，为宫颈癌的早期诊断和预后评估等提供了更多选择空间。Liu等[15]通过PBSⅡ-C蛋白芯片技术、运用Biomarker Wizard系统分析血清差异多肽谱，筛选确定了3个相对分子质量分别为3 974、4 175、5 906的差异多肽，这3个差异多肽预测宫颈癌的敏感性为93.3%、特异性为95.0%，表明血清差异多肽可用于宫颈癌的筛查。Song等[16]采用MALDI-TOF-MS技术发现了20个在宫颈癌血清中差异表达的多肽，经过免疫组化、PCR等筛选，确定B-FABP、NCK-1、CDK4可作为宫颈癌的肿瘤标志物，可用于宫颈癌的早期诊断及预后评估指标。

2.2 血清差异多肽谱在子宫内膜癌早期诊断中的应用 目前子宫内膜癌的筛查主要依靠诊断性刮宫，子宫内膜取材常用抽吸法，但抽吸法取材容易漏诊[17]。目前新的筛查策略业内尚未达成统一认识，临床上也缺少特异性高的早期诊断标志物[18]。寻找敏感、特异的子宫内膜癌分子标志物是早期预测子宫内膜癌的关键。已有学者研究证实，血清差异多肽可用于子宫内膜癌肿瘤标志物的筛选，为寻找子宫内膜癌的分子标志物提供了理论依据。Yoshizaki等[19]应用SELDITOF-MS技术发现子宫内膜癌患者血清中差异表达多肽EC1、EC2，并认为二者可能成为子宫内膜癌的肿瘤标志物。Li等[20]应用MALDI-Q-TOF技术筛选出了112个子宫内膜癌患者血清差异多肽，经鉴定确定亲环素A、表皮脂肪酸结合蛋白、Alcyphosine等为子宫内膜癌相关蛋白候选分子；并验证了该蛋白在子宫内膜癌组织中表达明显变化，且其表达变化与子宫内膜癌组织病理学分级有关。Zhu等[21]利用SELDI-TOF-MS技术筛选了子宫内膜癌患者13个相对分子量为2 000～50 000的血清差异多肽，并建立子宫内膜癌多肽谱模型，发现其诊断子宫内膜癌的敏感性为92.5%、特异性为100%、诊断符合率为95.7%。

2.3 血清差异多肽谱在卵巢癌早期诊断中的应用 目前尚无标准的卵巢癌筛查方法。血清肿瘤标志物在卵巢癌诊断中具有重要价值，但多数标志物敏感性不高、特异性不强[22]。仇志琴等[23]应用MALDI-TOF-MS技术筛选上皮性卵巢癌的血清差异多肽，建立的血清差异多肽诊断模型预测早期卵巢癌的准确性达到81.8%。Qiu等[24]利用MB-WCX预处理卵巢癌患者血清样本，采用ClinProTools软件分析获得了5个作为两组分类的差异多肽和蛋白，建立了卵巢癌血清诊断模型，其敏感性及特异性均在90%以上，提示MALDI-TOF-MS技术可作为卵巢癌早期诊断的潜在分子生物学标志物。Li等[25]通过MALDI-TOF-MS技术对上皮性卵巢癌耐药细胞株的22个蛋白质点进行分析，其中16个蛋白质表达了强度不同的特异性，并且确定了丝切蛋白1在紫杉醇抗性中发挥重要作用，这为卵巢癌耐药机制的研究奠定了基础，也为临床选药、评估疗效以及药物靶向治疗提供实验基础。Zhang等[26]通过MALDI-TOF技术发现，卵巢癌患者血清载脂蛋白A1、甲状腺素转运蛋白水平低于正常健康者；之后，基于蛋白组学图谱发现了联合标志物OVA1，包括CA125、载脂蛋白A1、甲状腺素转运蛋白、β2微球蛋白和转铁蛋白，可作为预测卵巢肿瘤的辅助手段[27]。因此，血清差异多肽谱能够作为卵巢癌的分子标志物，是早期筛查子宫内膜癌的一种新方法。

综上所述，利用血清多肽差异谱技术能成功地筛选出宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等女性生殖系统恶性肿瘤的差异多肽，并通过血清差异多肽建立多种针对女性生殖系统恶性肿瘤的血清差异多肽谱诊断模型，其敏感性高、特异性好，对女性生殖系统恶性肿瘤的早期诊断、预后评估等具有重要的指导意义。但临床还需要在大规模样本中进一步验证。另外，由于样本选取标准、预处理方法不同、分析软件以及人为因素等原因，导致实验结果的差异蛋白有所不同，未来需要更大规模的规范审查以制订规范化的诊断标准。

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