下调lncRNA CRNDE表达对结直肠癌HCT116细胞增殖和迁移的影响

高志鹏，徐万鹏，乔斌，杨斌林，段全红

(1 潍坊医学院，山东潍坊261053；2 潍坊医学院附属医院)

研究发现，多种长链非编码RNA(lncRNA)在恶性肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色[1～4]。结直肠恶性肿瘤差异表达基因(CRNDE)是一种较早发现于结直肠癌细胞中的高表达lncRNA。已有研究报道，在胶质瘤、髓母细胞瘤、肾癌等多种肿瘤组织中lncRNA CRNDE表达上调[5～7]。Liu等[8]研究发现，结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达变化与患者预后有关。但lncRNA CRNDE在结直肠癌细胞增殖及迁移中的作用鲜见报道。2016年11月～2017年6月，本研究通过siRNA技术靶向干扰结直肠癌HCT116细胞(以下称HCT116细胞)中lncRNA CRNDE表达，观察lncRNA CRNDE表达变化对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HCT116细胞，购自中国科学院细胞库。lncRNA CRNDE特异性siRNA，由上海吉玛制药技术有限公司合成；lncRNA CRNDE及GAPDH PCR引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。Mastercycler Ep Realplex实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度计、Multiskan MK3型酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯株式会社。McCOY′s5A细胞培养液，美国Solarbio公司；Opti-MEM®Ⅰ Reduced Serum Medium，美国Gibco公司；Lipofectamine®2000，美国Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 细胞培养传代 将HCT116细胞接种于含10% FBS McCOY′s5A培养液的培养瓶，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞融合达90%时，加入0.25% Trypsin-EDTA消化，按1∶3比例传代。取传10代内对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 lncRNA CRNDE-siRNA转染及转染效率验证 将对数生长期HCT116细胞接种于6孔板，每孔2×105个，随机分为CRNDE siRNA组、阴性对照组、空白对照组，每组设3个复孔。各组常规培养24 h，CRNDE siRNA组加入lncRNA CRNDE-siRNA(正义链：5′-GCUCGAGUGGUUUAAAUAUTT-3′，反义链：5′-AUAUUUAAACCACUCGAGCTT-3′)转染，阴性对照组加入无关序列NC-siRNA(正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACG-UGACACGUUCGGAGAATT-3′)转染，空白对照组不予转染。所有操作严格按Lipofectamine®2000说明书进行。各组均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。转染48 h，收集细胞，采用RNAiso Plus提取细胞总RNA，经NanoDrop 2000c超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，提取的总RNA纯度和完整性符合实验要求。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒说明将提取的总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。根据CRNDE信息，使用Primer5.0软件设计引物。引物序列：lncRNA CRNDE上游引物5′-CGCG-CCCGCGCGGCGGAGGA-3′，下游引物5′-AGTATGAATTGCAGACTTTGCA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA CRNDE mRNA相对表达量。结果显示，空白对照组、阴性对照组、CRNDE siRNA组lncRNA CRNDE mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、0.923±0.015、0.135±0.023。CRNDE siRNA组lncRNA CRNDE mRNA相对表达量明显低于空白对照组、阴性对照组(P均<0.05)，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明lncRNA CRNDE-siRNA成功下调了HCT116细胞lncRNA CRNDE表达。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取对数生长期HCT116细胞，按1.3中方法进行分组和转染。各组分别于转染24、48、72 h每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、5% CO2、饱和湿度下孵育3 h，Multiskan MK3型酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值。以A450值表示细胞增殖能力。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。实验前预先用记号笔在6孔板每孔背面横穿孔心均匀、笔直地画横线。取对数生长期HCT116细胞，按1.3中方法进行分组和转染。转染24 h，使用微量移液器枪头垂直于预先画好的横线再次划痕，PBS小心漂洗3次，去除划下的细胞。随机挑选3个视野，记录位置并拍照。将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养48 h，显微镜下拍照，采用Image-Pro Plus6.0软件测量各组细胞迁移距离。

2 结果

2.1 各组转染不同时间细胞增殖能力比较 见表1。

表1 各组转染不同时间细胞增殖能力比较

注：与空白对照组同时间比较，*P<0.05；与阴性对照组同时间比较，#P<0.05；与同组转染24 h比较，△P<0.05；与同组转染48 h比较，▲P<0.05。

2.2 各组细胞迁移能力比较 CRNDE siRNA组、阴性对照组、空白对照组转染24 h细胞迁移距离分别为(5.265±0.443)、(16.188±0.799)、(18.233±2.087)pixel。CRNDE siRNA组细胞迁移距离明显小于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

lncRNA广泛存在于细胞核和细胞质中，是长度大于200个核苷酸、不能编码蛋白质但具有基因表达调节功能的一类RNA[9]。lncRNA在转录调控、转录后调控及表观遗传学调控方面具有重要作用，如染色体修饰、X染色体沉默、DNA甲基化、干扰核内运输、转录激活或沉默等[10]。在恶性肿瘤的发生、发展中，常伴随lncRNA异常表达。Svoboda等[11]报道，在结直肠癌组织中lncRNA HOTAIR可出现差异表达，并与肿瘤分期、淋巴结转移及患者预后密切相关。Alaiyan等[12]研究发现，lncRNA CCAT1在结直肠腺瘤进展至恶性肿瘤过程中表达逐步上调，并且其表达变化还与肿瘤转移有关。有研究还发现，lncRNA UCA1在结直肠癌细胞增殖、凋亡等一系列生物学过程中发挥重要作用[13]。由此推测，lncRNA异常表达可能与恶性肿瘤的发生、发展有关。

在众多与结直肠癌相关的lncRNA中，CRNDE是一种在结直肠癌细胞中最早发现的差异性高表达lncRNA。Graham等[14]研究发现，结直肠癌患者血清中lncRNA CRNDE高表达。Liu等[8]研究证实，在结直肠癌组织中lncRNA CRNDE高表达，并与肿瘤转移和患者不良预后密切相关。有研究还发现，lncRNA CRNDE在宫颈癌、急性粒细胞白血病、前列腺癌等组织或细胞中的表达亦明显升高，并与疾病进展有关[15～17]。由此推断，lncRNA CRNDE在肿瘤的发生、发展过程中具有癌基因作用。Khalil等[18]研究发现，lncRNA CRNDE和染色质修饰复合体多梳蛋白聚合体2(PRC2)基因与组蛋白的重组过程有关，并且lncRNA CRNDE可通过甲基化或去甲基化的方式影响PRC2和RE-1元件辅助沉默因子相关基因表达。因此推测，lncRNA CRNDE可通过表观遗传修饰来调控肿瘤的发生、进展。lncRNA CRNDE转录本表达受胰岛素/IGF起始的PI3K/Akt/mTOR和Raf/MAPK两条信号通路调控。Ellis等[19]通过抑制结直肠癌细胞HCT116和HT29中lncRNA CRNDE gVC-In4转录本的表达发现，其可影响一系列与insulin/IGF通路相关的基因表达。据此推测，lncRNA CRNDE可能参与肿瘤细胞有氧糖酵解的调控，继而参与结直肠癌的发生、发展。但目前关于抑制lncRNA CRNDE表达对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响鲜有报道。

本研究利用siRNA技术靶向抑制结直肠癌HCT116细胞lncRNA CRNDE表达，观察下调lncRNA CRNDE表达对HCT116细胞增殖和迁移的影响。结果发现，随着转染时间延长，各组细胞增殖能力逐渐升高，但CRNDE siRNA组转染24、48、72 h细胞增殖能力均低于同期阴性对照组和空白对照组；CRNDE siRNA组转染24 h再培养48 h细胞迁移距离均小于阴性对照组和空白对照组。上述结果证实，下调lncRNA CRNDE表达可抑制HCT116细胞增殖和迁移。据此推测lncRNA CRNDE可能促进结直肠癌的侵袭和转移。

综上所述，下调lncRNA CRNDE表达能抑制结直肠癌细胞增殖和迁移。本研究为探讨结直肠癌侵袭和转移的分子机制及其治疗潜在靶点提供了新思路。

参考文献：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Xiao YC, Yang ZB, Cheng XS, et al. CXCL8, overexpressed in colorectal cancer, enhances the resistance of colorectal cancer cells to anoikis[J]. Cancer Lett, 2015,361(1):22-32.

[3] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[4] Gutschner T, Diederichs S. The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view[J]. RNA Biol, 2012,9(6):703-719.

[5] Guttman M, Amit I, Garber M, et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals[J]. Nature, 2009,458(7235):223-237.

[6] Harrington S, McGurk M, Llewellyn CD. Positive consequences of head and neck cancer: key correlates of finding benefit[J]. J Psychosoc Oncol, 2008,26(3):43-62.

[7] Kate N, Grover S, Kulhara P, et al. Relationship of caregiver burden with coping strategies, social support, psychological morbidity, and quality of life in the caregivers of schizophrenia[J]. Asian J Psychiatr, 2013,6(5):380-388.

[8] Liu T, Zhang X, Yang YM, et al. Increased expression of the long noncoding RNA CRNDE-h indicates a poor prognosis in colorectal cancer, and is positively correlated with IRX5 mRNA expression[J]. Onco Targets Ther, 2016(9):1437-1448.

[9] Chen LL, Carmichael GG. Long noncoding RNAs in mammalian cells: what, where, and why[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2010,1(1):2-21.

[10] Li CH, Chen Y. Targeting long non-coding RNAs in cancers: progress and prospects[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(8):1895-1910.

[11] Svoboda M, Slyskova J, Schneiderova M, et al. HOTAIR long non-coding RNA is a negative prognostic factor not only in primary tumors, but also in the blood of colorectal cancer patients[J]. Carcinogenesis, 2014,35(7):1510-1515.

[12] Alaiyan B, Ilyayev N, Stojadinovic A, et al. Differential expression of colon cancer associated transcript1 (CCAT1) along the colonic adenoma-carcinoma sequence[J]. BMC Cancer, 2013(13):196.

[13] Han Y, Yang YN, Yuan HH, et al. UCA1, a long non-coding RNA up-regulated in colorectal cancer influences cell proliferation, apoptosis and cell cycle distribution[J]. Pathology, 2014,46(5):396-401.

[14] Graham LD, Pedersen SK, Brown GS, et al. Colorectal Neoplasia Differentially Expressed (CRNDE), a novel gene with elevated expression in colorectal adenomas and adenocarcinomas[J]. Genes Cancer, 2011,2(8):829-840.

[15] Chaves C, Vazquez C, Hervas G. Benefit finding and well-being in children with life threatening illnesses: an integrative study[J]. Terapia Psicologica, 2013,31(1):59-68.

[16] Le Dieu R, Taussig DC, Ramsay AG, et al. Peripheral blood T cells in acute myeloid leukemia (AML) patients at diagnosis have abnormal phenotype and genotype and form defective immune synapses with AML blasts[J]. Blood, 2009,114(18):3909-3916.

[17] Pressinotti NC, Klocker H, Schäfer G, et al. Differential expression of apoptotic genes PDIA3 and MAP3K5 distinguishes between low- and high-risk prostate cancer[J]. Mol Cancer, 2009(8):130.

[18] Khalil AM, Guttman M, Huarte M, et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression[J]. Proc Nati Acad Sci U S A, 2009,106(28):11667-11672.

[19] Ellis BC, Graham LD, Molloy PL. CRNDE, a long non-coding RNA responsive to insulin/IGF signaling, regulates genes involved in central metabolism[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1843(2):372-386.