甜荞组织培养研究进展

王兰香，刘志雄

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

甜荞(FagopyrumesculentumMoench.)是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)非禾谷类食药同源的经济作物，其种子富含赖氨酸、芦丁和抗氧化活性物等，具有很高的营养价值和保健功效。甜荞还具有生育期短、耐瘠薄、抗旱耐涝抗等优点，在亚洲、欧洲、北美等地区广泛栽培，是一种集营养保健、医药、蜜源和观赏等多用途的经济作物[1,2]。然而，甜荞自然群体内长雌蕊短雄蕊(pin型)和短雌蕊长雄蕊(thrum型)花植株呈1∶1分离，仅pin和thrum型植株花间相互授粉能正常结实，自花或同型花间授粉不亲和，自然结实率低，杂交育种困难；另外，甜荞的无限花序导致同一植株甚至同一花序上存在不同发育时期的籽粒，很难确定合适的收获时间，不利于机械化采收，加之落粒性严重，严重制约着这一重要经济作物的推广应用。创制甜荞新种质，是加快这一重要经济作物推广应用的前提和基础。

植物组织培养技术因具有繁殖系数高、繁殖周期短、繁殖速度快且不受季节限制等优点，广泛应用于农业产业化开发、种质资源保存、基因工程育种等方面。基于植物组织培养技术的植物遗传转化体系的建立，是利用基因工程创制甜荞新种质的基础和前提，同时还能为甜荞的倍性育种积累资料和技术。目前，国内外均已建立了完整的甜荞离体培养体系，但存在着愈伤组织褐化严重、继代培养困难、再生率低等问题。关于甜荞体细胞胚胎发生也有报道，但通过体细胞胚胎发生途径的植株再生率较低，且发生体系尚不完善。在综述近年国内外关于甜荞组织培养研究进展的基础上，分析目前甜荞组织培养面临的技术难题和瓶颈，并对后期的研究方向进行展望，以期为建立甜荞离体培养体系和遗传转化体系积累资料并提供参考。

1 种子无菌萌发

种子无菌萌发是以成熟种子经人工脱毒后在无菌条件下萌发长成幼苗的一种繁殖途径，多用于解决种子休眠或萌发困难等问题，在甜荞组织培养中则是用来获得无菌的外植体材料。成熟的甜荞种子人工去皮后，经0.1% HgCl2或2 % NaClO浸泡灭菌15～18min，杀菌消毒，后接入无激素MS培养基中即可萌发，与NaClO相比，HgCI2灭菌效果较好。

金红等[3]将成熟甜荞种子剥去种皮，用0.1%HgCI2(含少量吐温-80)溶液灭菌18min后接种到无激素MS固体培养基上萌发获得无菌苗。陈佳[4]对甜荞无菌苗的萌发培养进行优化，将人工去皮后的成熟种子用2 %NaClO的溶液灭菌15min后接入到1/2 MS中，其光照培养条件下萌发率高达78%。

2 外植体选择与预处理

2.1 外植体的选择

植物的细胞、组织、器官均可作为组织培养的外植体，但不同类型外植体的愈伤诱导及植株再生能力存在着一定的差异。在甜荞组织培养中，无菌苗子叶和下胚轴是较为常用的外植体[3,5～7]，其幼嫩茎段[8]、叶柄[9]、未成熟胚[10,11]、未成熟花序[12]、花药[13]、原生质体[14]等，经愈伤诱导后均能成功获得再生植株。而同属的苦荞(FagopyrumtataricumGaertn.)和金荞麦[Fagopyrumdibotrys( D.Don) Hara]，除无菌苗的子叶和下胚轴外[15～17]，叶片[18]、叶柄[19]、茎段[20]、腋芽[21]也可作为外植体，经愈伤诱导后均能成功获得再生植株。

前人研究表明，甜荞幼嫩茎段形成愈伤组织的能力高于叶片，且愈伤组织生长较快[6]。当用子叶作外植体的愈伤诱导培养中，子叶上容易长出细白的毛状根，甚至不产生愈伤组织[22]。而以茎段为外植体时，靠近顶芽部分的实心茎段最佳，空心茎段不易于消毒灭菌且褐化严重[8]。在同一培养基中，甜荞下胚轴的分化率明显高于子叶[23]。同样，在相同培养条件下，苦荞下胚轴的愈伤诱导率和分化率均高于子叶[16]。由此可见，在荞麦属植物中，无论是甜荞还是苦荞，下胚轴比子叶更适合用作离体培养的外植体。

2.2 外植体的预处理

正常情况下，甜荞5～15d苗龄的无菌幼苗、子叶和下胚轴是较为理想的外植体。但若选取自然生长的甜荞器官作外植体，则要进行一定的预处理。王爱国等[24]用不同的消毒方式处理甜荞外植体发现，经70%酒精消毒杀菌30s后，转入0.1%HgCl2消毒灭菌10min，灭菌效果最好。对于开花期前的甜荞顶端幼嫩的实心茎段，经0.1%HgCl2消毒3min，无菌水清洗数次后即可接入到培养基中诱导愈伤组织[8]。 Neskovic等[10]以甜荞未成熟胚为外植体时，用0.1%HgCl2中消毒10min，再在商业次氯酸钠(0.4%活性氯)中消毒20min，无菌水清洗数次后接入培养基中诱导愈伤，获得再生植株。黄仁术等[25]对金荞带节茎段的HgCl2消毒时间进行研究，在浓度为0.1%HgCl2溶液中，最佳消毒时间为6min。

3 器官发生途径

器官发生途径是甜荞组织培养中主要的再生途径，分为直接器官发生和间接器官发生，从外植体上直接分化不定芽为直接器官发生方式，外植体经过脱分化诱导的愈伤组织上分化不定芽从而形成完整植株为间接器官发生方式。

3.1 愈伤组织诱导

植物生长调节剂对外植体脱分化形成愈伤组织有着至关重要的作用，不同外植体在组织培养中可直接或间接形成不定芽，培养基中激素种类与浓度是外植体愈伤诱导与形态建成的主要因素。以甜荞腋芽为外植体时，在MS+6-BA 4.0mg/L+TDZ 0.06mg/L培养基上直接诱导丛生芽，其分化率达166.7%[26]。赵钢等[8]研究表明，2,4-D、6-BA、KT对甜荞幼嫩茎段的愈伤诱导均有促进作用，2,4-D的效果最为显著，甜荞茎段愈伤诱导的最佳培养基为2,4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L的MS培养基。柴瑞娟等[27]以甜荞幼茎、幼叶为外植体，在MS+2,4-D 7.0mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基上，幼茎愈伤诱导率为100%，幼叶的愈伤诱导率也达到97.3%。甜荞子叶和下胚轴在2,4-D 1.5～2.0mg/L+6-BA 0.5～1.5mg/L的MS培养基上即可大量诱导愈伤组织，愈伤诱导率可以达到100%，叶片和叶柄在此激素浓度范围内，愈伤诱导率也较高[7,9,23]。

与甜荞相比，苦荞和金荞在愈伤组织诱导培养中，所需激素浓度略有不同。王跃华等[19]对苦荞叶柄愈伤组织诱导培养中，随着2,4-D浓度在1.0～4.0mg/L范围内逐渐增高，愈伤诱导率也随之升高，当2,4-D浓度为4.0mg/L时愈伤诱导率为100%，而6-BA对其愈伤组织诱导的影响不显著。吴崇明等[16]以苦荞子叶和下胚轴为外植体，在IAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+TDZ 0.5mg/L的MS培养基上，子叶愈伤诱导率达75%左右，下胚轴愈伤诱导率可高达86.62 %，抗氧化剂AgNO3能有效降低愈伤组织褐化率。而金荞叶片在2,4-D 4.0mg/L+6-BA 1.0mg/L的MS培养基上愈伤诱导率达89%[18]。

3.2 愈伤组织增殖及分化

甜荞的愈伤组织在继代、分化培养过程中，容易发生褐化，且随着继代时间的延长，愈伤组织的分化能力逐渐降低且褐化程度加重。陈发菊等[6]认为适宜甜荞愈伤组织生长的激素组合为 2.4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L。JIN等[28]研究表明，大约21.5%的甜荞愈伤组织在MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 1.5mg/L的培养基中继代近1年后转至MS+6-BA 2.0mg/L+KT l.0mg/L的培养基中能够分化丛生芽。Lee等[29]研究发现，甜荞子叶在含有BAP 4.0mg/L的MS培养基上所获得的再生芽数量与相同浓度的KT相比差异显著，培养基中添加7mg/L AgNO3大大改善了芽再生频率，其比对照组高约30%。在6-BA 2.0mg/L+IAA 0.lmg/L+KT lmg/L的MS培养基上，子叶和下胚轴的分化率分别为42.5%和73.6%，下胚轴的分化率明显高于子叶[23]。Veroslava等[30]研究了赤霉素(GA3)对甜荞子叶器官发生的影响，结果表明赤霉素对愈伤诱导没有抑制作用，而对器官发生抑制作用显著。

Mangkita等[31]用3周龄的幼芽为材料，建立了苦荞的快繁体系，在添加20μmol/L BAP、3%蔗糖和1g/L结冷胶的改良MS培养基上，6周即可获得大量丛生芽。闫超敏等[32]研究表明，在MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L培养基上，九江苦荞愈伤组织芽分化率为26.9%，伴有玻璃化现象。陈彩霞等[18]研究发现金荞麦愈伤组织分化不定芽的适宜培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L。而林静等[20]发现在1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L(或 IBA 0.3mg/L)+2,4-D 0.1mg/L培养基上，金荞愈伤组织最快1个月重量增加约3倍。

4 体细胞胚胎发生途径

胚胎发生途径是离体培养过程中从体细胞中产生的胚状体，不经过性细胞融合但发育过程与合子胚相似，由外植体脱分化直接形成或外植体先诱导愈伤再脱分化间接形成。外植体类型、外源激素种类和浓度对甜荞体细胞胚胎的发生至关重要，2,4-D、6-BA、KT是甜荞体细胞胚胎诱导中常用的外源激素，因外植体不同，所需激素浓度和种类均有不同。

Sun Hee等[33]将甜荞子叶在含有2,4-D 2.0mg/L+KIN 0.2mg/L的MS培养基上诱导愈伤后，将脆性愈伤组织在KIN 0.2mg/L+BAP 2.0mg/L+3%蔗糖的MS培养基上诱导体细胞胚胎，其发生率为32%。Kwon等[34]以甜荞下胚轴诱导获得的黄色易脆的愈伤转接到IAA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L中培养2周后分化出体细胞胚。Gumerova等[35]在含有2,4-D(6mg/L)的液体B5培养基中培养甜荞下胚轴6周后分化出原始细胞复合物(Proembryogenic Cell Complexes)，但在高浓度2,4-D(8mg/L)的培养基中培养8d即可获得大量的原始细胞复合物，随后转至不含或少量2,4-D(0～2.0mg/L)的培养基中，分化出体细胞胚胎并获得完整植株。Neskovic等[10]将甜荞幼胚在添加有2,4-D和KT的B5培养基中培养5d后转至含有BAP 2.2mg/L和IAA 0.17mg/L的培养基中，能够产生体细胞胚的愈伤组织。李占旗[15]将苦荞子叶和下胚轴诱导的愈伤组织转接到2,4-D 2.0mg/L+KT 0.1mg/L的MS培养基上继代，胚性愈伤诱导率都高。Cheng 等[36]对苦荞品种“西昌”、“园子”无菌苗的子叶和下胚轴体胚发生的研究，“园子”下胚轴在2,4-D 2.0mg/L+KT 1.0mg/L的MS培养基上体细胞胚诱导率为98.96%，子叶体细胞胚的诱导率为84.36%，下胚轴比子叶适合诱导体细胞胚。

5 植株再生

将愈伤分化和体细胞胚胎分化获得的不定芽转接到生根培养基中，进行生根培养，以获得完整的再生植株。甜荞不定芽的生根培养基主要有MS和1/2MS 2种，生根培养所需的生长素与细胞分裂素的浓度比例与甜荞品种有关。

甜荞品种北早生的离体培养体系中，不定芽接种于NAA 0.6mg/L的1/2MS培养基上生根率100%，经炼苗后移栽存活率可达70%以上[4]。陈发菊等[6]将甜荞不定芽接种到含MS+IBA 2.0mg/L+KT 0.1mg/L 的培养基上，根的诱导率可达78.9%。陈利红等[23]将甜荞愈伤组织中分化出生长状态良好的不定芽，转接到含有IBA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的1/2MS培养基上生根，所有转接的不定芽均可生根。Lee等[29]认为在不添加植物激素的MS培养基中，甜荞不定芽也可以正常生根，炼苗移栽后存活率为72%。Hou[37]对温莎甜荞和九江苦荞的再生体系进行研究，发现当NAA与6-BA的比例为1.0～2.0时，九江苦荞比温莎甜荞的再生率高，表明不同基因型的荞麦对植物激素的敏感度不同。吴崇明等[16]、王跃华等[19]对苦荞再生体系的研究中表明，苦荞不定芽在MS+IBA 0.5mg/L和1/2MS+NAA 0.5mg/L培养基上，根的诱导率分别为85.0%和50.0%，经炼苗后移栽于松软的土壤中，成活率达90%。

6 结语

与大宗作物相比，甜荞的离体培养和遗传转化体系严重滞后，虽已有完整的甜荞离体培养体系，但依然存在着愈伤组织褐化严重、分化率低的问题，尤其是体细胞胚胎发生途径。降低愈伤组织褐化和提高分化率是目前甜荞离体培养体系亟待优化的2个方面。甜荞、苦荞、金荞3种荞麦的愈伤组织诱导及分化培养中，外植体类型和激素浓度的差异可能是基因型不同而引起的。

随着生活水平的提高，人们在饮食方面更加追求绿色、健康，甜荞的营养价值和药用价值也逐渐被认识，对甜荞的需求量也越来越大。然而在栽培过程中，其籽粒成熟期不一致且落粒严重，产量低。不断完善甜荞离体培养体系，对于外源优良基因的遗传转化、优质新品种的选育具有重要意义。稳定、高效的再生体系，有利于甜荞遗传转化和基因工程育种等方面的深入研究，为甜荞品种改良及培育新品种积累材料和技术，进而改变甜荞现有的性状，提高产量及抗性。