网络药理学和生物信息学方法在骨碎补治疗股骨头坏死分子机制研究中的应用

骆帝，许波，李刚，梁学振，盖帅帅，阎博昭，李嘉程，夏聪敏(山东中医药大学，济南250355)

股骨头坏死(ONFH)是一种常见、难治的骨科疾病，以骨组织结构破坏及力学性能改变为主要表现。ONFH病理机制尚不完全清楚，误诊误治或延误病情可引起关节软骨和软骨下骨塌陷，并继发骨性关节炎。双膦酸盐类药物、抗凝药物、血管扩张药物、调节骨代谢药物等为目前治疗ONFH的常用西药[1]，但其成分和靶向性单一，不能逆转ONFH的疾病进展[2]。中医治疗ONFH以“补肾健骨”为治疗原则，以“肾主骨生髓”为组方原则，骨碎补为组方主药。骨碎补性温，味苦，归肾、肝经，具有疗伤止痛、补肾强骨的功效[3]。现代药理研究证实，骨碎补可促进成骨细胞增殖及分化成熟，促进股骨头骨再生、抑制破骨细胞活性，促进骨对钙的吸收，调节血钙和血磷水平，改善股骨头内环境[4～6]。骨碎补的分子作用机制至今尚不明确。随着网络药理学和生物信息学理论的建立与发展，中药潜在活性成分和作用靶点逐渐成为研究热点。2017年9～10月，本研究通过筛选和预测骨碎补及ONFH的相关靶点，并对其进行富集分析，探讨骨碎补治疗ONFH可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 骨碎补入血活性成分筛选 通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[7]，挖掘骨碎补所有成分数据，根据成分毒药物动力学(ADME)参数[8～10]进行筛选。筛选条件[11,12]：药物口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18；同时结合前期研究结果及跟踪文献对其入血活性成分进行完善。

1.2 骨碎补作用靶点预测及“活性成分-靶点网络”构建 通过TCMSP 靶点预测上述入血活性成分的作用靶点，采用网络图像化软件Cytoscape 3.2.1[13]对活性成分及作用靶点进行相关网络构建，其中“节点”表示分子、靶蛋白，“边”表示成分与靶点之间的关系；采用network analyzer插件进行网络特征分析，明确骨碎补中较为重要的成分和靶点，结合文献分析其中的相互作用。

1.3 已知的ONFH相关靶点检索 通过药物靶标数据库TTD[14](http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、药物银行DrugBank[15](https://www.drugbank.ca/)、人类孟德尔遗传在线数据库OMIM[16](http://www.omim.org/)、遗传关联数据库GAD[17](https://geneticassociationdb.nih.gov/)、药物基因数据库PharmGKB[18](https://www.pharmgkb.org/)等与疾病靶点相关的数据库，以“osteonecrosis”作为关键词对已知的ONFH相关靶点进行检索及筛选，获得ONFH发病过程中的已知靶点。

1.4 骨碎补治疗ONFH的蛋白质-蛋白质相互关系(PPI)网络构建和关键靶点筛选 使用BisoGenet插件对上述获得的入血活性成分及ONFH相关靶点进行PPI网络绘制，采用Cytoscape软件对已绘制好的2个网络图融合并抽取交集网络，即可得到骨碎补治疗ONFH的直接和间接靶点调控网络图。通过网络拓扑分析插件CytoNCA[19]并结合相关文献，借助度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、网络中心性(NC)和局部边连通性(LAC)等指标进行筛选，其中DC大于所有节点DC值中位数2倍的节点为网络中的重要节点，即“Big hubs”；然后再筛选其他几个指标大于所有节点中位数的节点，即关键靶点。

1.5 骨碎补治疗ONFH的机制分析 采用Pathway富集分析。通过基因富集分析插件ClueGO[20]对上述获得的关键靶点进行信号通路富集分析，以节点的形式将结果以图像化形式展现；同时根据重要程度绘制信号通路占比饼状图，以分析关键靶点参与的主要信号通路，研究骨碎补治疗ONFH可能的作用机制。其中，同一种颜色的节点代表同一类型的信号通路，节点的大小代表信号通路的显著性，节点越大说明信号通路的显著性越高，即该通路的重要性越高。

2 结果

2.1 骨碎补入血活性成分筛选与ADME分析结果 本研究通过TCMSP数据库共检索到骨碎补已报道的所有入血活性成分共72个，根据OB和DL等ADME参数筛选到入血活性成分18个。

2.2 骨碎补作用靶点预测及“活性成分-靶点网络”构建结果 本研究利用TCMSP靶点预测模型预测技术共获得预测靶点92个；利用网络图形化工具Cytoscape3.2.1得到骨碎补发挥重要作用的入血活性成分与其对应作用靶点的相互关系共260个。

2.3 ONFH相关靶点检索结果 共获得与ONFH发生、发展密切相关的已知相关靶点72个，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 数据库分别检索到2、0、3、46、34个靶点。

2.4 骨碎补治疗ONFH的PPI网络构建与关键靶点筛选分析结果

2.4.1 骨碎补治疗ONFH的PPI网络构建结果 与骨碎补入血活性成分产生直接或间接作用的靶点共5 834个，靶点与靶点之间的相互关系共132 036个。与ONFH发病直接或者间接相关的靶点共2 594个，靶点与靶点之间的相互关系共59 937个。

2.4.2 骨碎补治疗ONFH的关键靶点筛选分析结果 根据网络节点的拓扑属性筛选共发现骨碎补治疗ONFH的关键靶点92个。

2.5 骨碎补治疗ONFH的机制分析结果 对上述92个关键靶点进行的Pathway富集分析结果显示，骨碎补治疗ONFH的关键靶点涉及的信号通路主要与细胞周期、炎症、癌症等35条显著富集的信号通路相关。

3 讨论

目前临床治疗ONFH的方法较多，包括中药及西药内服外用、保护性负重、保髋手术、介入治疗、高压氧、体外冲击波和人工关节置换术等。早中期患者多采取非手术治疗手段，晚期患者多首选手术治疗。传统医学认为，肾为先天之本，肾主骨，骨生髓，肾精系一身生命的根本，决定人的生长、发育与生殖等。ONFH临床辩证多属肾精亏虚，所以治法多以补肾为主。骨碎补是水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎，是治疗ONFH的骨伤科常用中药[21，22]。机体内的调控机制通常不是单一的信号通路支配，而是复杂的调控网络；不同的信号通路和靶点之间存在一定程度的信号转导，故药物的有效成分不单单体现在与成分靶点的直接结合，而是更多通过直接、间接的方式与其他靶点结合。通过PPI数据的构建与挖掘，使靶点的直接、间接调控作用关系能清晰可靠地得到呈现。本研究通过筛选获得骨碎补中入血的活性成分18个，并在此基础上挖掘出92个可能的靶点和260个相互关系。“活性成分-靶点网络”分析显示，木犀草素、β-谷固醇、山奈酚、豆甾醇、儿茶素、没食子酸酯等有效成分能作用于网络中的多个靶点，PRSS1、ESR1、AR等靶点也能与多个成分形成作用关系。证实骨碎补的有效成分之间不仅存在紧密的协同关系，而且其作用靶点也在ONFH的疾病进程中发挥重要作用。

本研究Pathway信号通路富集分析显示，骨碎补作用于ONFH的关键靶点涉及的信号通路主要富集于细胞周期、炎症、癌症相关等35条信号通路。①细胞周期相关通路。细胞周期的准确调控对生物体正常的生存、繁殖、发育和遗传具有决定性作用[23]。骨细胞的生长、凋亡及分化可直接影响骨吸收和骨重建的动态平衡，因此细胞周期相关的信号通路是调控ONFH发病机制中重要的一环。本研究结果显示，骨碎补作用于ONFH的机制主要富集在Wnt、p53、PI3K/Akt、HIF-1、Notch、DNA复制、泛素介导的蛋白质水解、核苷酸切除修复、错配修复、卵母细胞减数分裂、剪接体、黏合连接及细胞凋亡等信号通路等。Wnt信号通路可通过调控骨髓间充质干细胞的分化方向和早期的分化潜能，以促进更新速度、成骨分化并抑制成脂[24]。p53是公认的、与细胞凋亡相关的蛋白质分子，具有诱导细胞凋亡的功能，其在G1期发挥检查点的作用，可决定是否启动细胞凋亡程序[25]。研究证实，p53基因表达上调与阻止细胞凋亡的bcl-2基因下调共同在ONFH发展过程中发挥重要调节作用[26]。ONFH患者p53基因上调后可通过PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡[27]。低氧诱导因子1α(HIF-1α) 是生物体内最具特征性的低氧反应信号通路。HIF-1α信号通路在体内缺血、缺氧环境下可改变一系列细胞功能，使其产生适应性反应，对骨形成和血管生成发挥重要的调控作用[28]。Notch信号通路可调节成骨细胞和破骨细胞分化和功能，从而控制骨重建[28]。②炎症相关通路。ONFH的病理机制具有炎症特性，主要富集于NF-κB信号通路等。NF-κB受体活化因子配基可直接影响破骨细胞的形成、分化和骨吸收的调节等[29]。③其他有关信号通路。骨碎补作用靶点富集分析结果显示，网络集群中还覆盖了EB病毒感染、泛素介导的蛋白水解、乙醇中毒及癌症等信号通路。

综上所述，骨碎补治疗ONFH具有多成分、多靶点的特点；其主要通路不仅直接参与骨细胞的增殖、凋亡及分化，调节成骨、破骨代谢平衡，还通过调节免疫、炎症反应等干预和影响骨微环境，以达到控制ONFH发生、发展的目的。骨碎补调控ONFH的靶点富集通路存在复杂的相互作用关系，治疗时应根据患者和疾病的不同情况，针对局部关键通路，因人制宜地采用个性化的多靶点、多系统疗法。

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