防龋的动物实验研究进展＊

卢 燕，蓝 海

龋齿又称“蛀牙”，是一种常见的牙齿组织被慢性破坏的感染性疾病，由细菌、食物、个体等多种因素引起，影响牙齿的美观、发声等功能［1，2］，若不及时治疗，会损害整个牙体造成严重的后果。

目前防龋动物的实验研究主要分为：对致龋菌生物膜的影响而改变致龋能力；抑制牙体脱矿促进再矿化增强牙齿的抗龋作用；从基因层面研究了免疫对致龋的影响，等三个方面。而目前致龋实验造模一直沿用了1964年Keyes等用的饲料配方［3］，主要通过向适龄大鼠喂养致龋饲料Keyes2000#（全麦粉6%，蔗糖56%，脱脂无糖奶粉28%，酵母4%，苜蓿粉3%，肝脏粉末1%，食盐2%）。

1 抑菌作用

变形链球菌生物膜持久存在于在口腔中是造成龋齿的主要原因之一。Garciad等［4］实验发现一种小分子3F1，能够选择性靶向变异链球菌生物膜，有效地减少体内龋齿，而不会影响口腔整体微生物群情况。Kulshrestha等［5］通过在扫描电镜下观察膜的完整性，发现氟化钙纳米颗粒（CaF2－NPs）能抑制变形链球菌生物膜的形成，减轻龋损情况。

有学者通过在药物中增加基质提高溶解度而达到更好的抑菌效果。Li等［6］研究一种提高溶解度的水难溶性醋酸氯正酸的新型纳米乳剂（CNE），用扫描电子显微镜和原子力显微镜检测变形链球菌生物膜，用透射电子显微镜观察变形链球菌的细胞膜形态，结果显示CNE在体内极大地改善了该试剂溶解性和抗微生物活性。

有学者通过深入研究发现药物靶向作用于致龋菌的基因。Klein等［7］从大鼠口腔内得到菌斑生物膜，研究发现可同时分析可行的微生物群体和基因表达，从而提供对龋齿传染性方面的全面评估。Falsetta等［8］评估氟化物新型联合疗法CT的抗龋作用时，深入研究发现了CT调节生物膜毒力的潜在机制，发现其主要靶向作用于变形链球菌生物膜形成过程中关键基因的表达。Bueno－Silva等［9］通过对大鼠接种变形链球菌，再用从巴西蜂胶中分离的新戊醇－含维斯体素（NV）每天两次涂布在大鼠口腔牙齿内，用激光共聚焦得到生物膜的胞外多糖（EPS）和细菌成像得到EPS和细菌的生物量、平均厚度和生物膜之前的差异，用优化的方案提取和纯化 RNA［10］，再进行基因组分析，葡糖基转移酶（Gtf）活性分析，结果发现NV的局部应用通过大量破坏葡糖基转移酶衍生的胞外多糖的合成和与适应性应激反应相关的基因的表达，大量损害变形链球菌的生物膜积累。

2 抑制牙齿脱矿促进再矿化

目前体内牙齿评分均用Keyes评分法［11］，在体视显微镜下对大鼠磨牙光滑面龋、窝沟面龋进行分类计分，龋损程度分为 E、Ds、Dm、Dx 四级，依次代表釉质龋、牙本质浅层龋、牙本质中层龋、牙本质深层龋。

Wu等［12］评估新型黏合剂对二次患龋动物的作用，用显微CT测量病变的深度和矿物质损失，用龋齿等级划分，发现新型黏合剂能显著降低病变深度和矿物损失，且龋齿等级评分降低。

DE等［13］研究了蜂胶清漆在大鼠体内的抗龋作用和其对成纤维细胞的毒性作用，对牙光滑面和沟槽龋齿评分，发现蜂胶清漆能防止光滑面釉质龋而且显示低细胞毒性。

Li等［14］研究磷酸钙纳米粒子（NACP）和抗菌二甲基氨基十二烷基甲基丙烯酸酯（DMADDM）掺入复合材料和黏合剂中对大鼠口腔的抗菌和再矿化修复情况，发现含NACP和DMADDM的复合材料和黏合剂有助于牙本质-牙髓复合体的愈合。

Baptista 等［15］研究了抗微生物光动力疗法（APDT）去矿物质作用的短期影响时，在实验开始后5 d，通过光学相干断层扫描术（OCT）确认早期龋坏病变。用OCT检查牙齿脱矿情况，实验发现治疗前后的光学衰减系数的变化为15%，龋齿发展受阻，表明APDT能减少牙矿物质的损失。

3 基因免疫

龋齿相关的病原体首先被成牙本质细胞识别并诱发发展为牙髓炎。微生物病原体的初始感应由模式识别受体介导，如Toll样受体和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）。Hosokawa 等［16］通过流式细胞仪检测大鼠牙本质细胞KN-3中NODs的表达水平，并用PCR和ELISA分析NOD特异性配体刺激的KN-3细胞中的趋化因子水平。发现NOD1通过p38-AP-1信号通路上调趋化因子在成牙本质细胞中表达，提示NOD1可能在牙髓炎的发生和发展中起重要作用。

Bao 等［17］研究了鞭毛蛋白-PAc 融合蛋白（KF-rPAc）作为新免疫方案对龋齿的黏膜疫苗的治疗效果。实验发现，将变形链球菌植入大鼠口腔后，通过鼻腔免疫的KF-rPAc可有效促进PAc特异性系统和黏膜抗体应答，并有效抑制龋齿发展。

Su等［18］研究基因IL-6的表达质粒 pCI-IL-6对编码变形链球菌表面蛋白抗原PAc的抗龋齿DNA疫苗pCIA-P的免疫原性的影响。通过在鼠IL-6基因插入pCI载体构建质粒pCI-IL-6。在大鼠龋齿模型中，pCI-IL-6共免疫大鼠表现出较低的龋齿评分。

Hung等［19］将成年雌性Wistar大鼠用抗龋DNA疫苗pGJA-P/VAX进行鼻内免疫，在免疫后的不同时间检查唾液中的S-IgA抗体水平及其对变形链球菌黏附的抑制。使用计数集落形成单位并使用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）确定每个阶段的活细菌数量和生物膜深度。发现抗龋齿DNA疫苗通过抑制变形链球菌初始黏附到牙齿表面上而诱导特异性S-IgA抗体的产生，减少变形链球菌薄膜上的积聚，从而预防龋齿。

Yoshioka 等［20］对 9 周龄的 Wister磨牙制备空腔后，对髓细胞进行了基因表达分析，发现金属蛋白酶抑制剂19（Timp1）连续广泛分布于下方的牙髓中，得出结论Timp1可能在未成熟牙髓细胞中重新激活第三次牙本质形成中发挥重要作用。

Pan等［21］测试了gcrR基因缺陷的细菌替代疗法的潜在抗龋作用，通过同源重组构建突变体，突变型MS-gcrR-def接种于大鼠模型，用激光共聚焦分析生物膜的形态特征，发现MS-gcrR-def具有更低的酸产量和更强的定植潜力，体内龋齿明显减少。

在唾液腺和其他部位发现的趋化因子CCL28有一定的抗菌活性，CCL28集合了携带CCR10的免疫细胞，特异性IgA抗体分泌细胞（IgA+ASCs）在膜表面表达CCR10，唾液腺中的IgA+ASC对致龋细菌的特异性免疫防御，CCL28由唾液腺腺泡上皮细胞表达也可以与唾液一起分泌到口腔中［22-29］。Jiang等［30］发现将重组质粒递送至大鼠腮腺，能够在唾液中诱导高水平的CCL28和SIgA，并且唾液中CCL28和SIgA的水平增加维持2 W，用重组质粒处理的大鼠的牙菌斑含有较少的变形链球菌。

Shi等［31］实验发现含来自沙门菌的重组鞭毛蛋白（Flic）可作为用于抗龋DNA疫苗的黏膜佐剂（pGJA－P/VAX）。PAc特异性IgA反应与抑制牙齿表面变形链球菌定植相关，有较好的保护作用，龋病发生明显减少。

Dinis等［32］研究了妊娠前母体接种远缘链球菌重组烯醇化酶rEnolase，产下的幼仔具有更高水平的rEnolase特异性唾液IgA和IgG抗体，和较低的龋齿等级评分。

此外，目前有研究发现糖尿病也会诱发龋齿的发生。Abbassy等［33］用微型计算机体层摄影术（micro－CT）检测患1型糖尿病大鼠牙釉质和牙本质的矿物质密度和厚度。用组织形态计量学研究检测牙本质矿物质沉积和形成的速率。结果显示牙釉质和牙本质厚度明显减少（发育不全），并且牙本质矿物质沉积和形成速率明显降低。Gutowskal等［34］实验发现1型糖尿病大鼠的血清葡萄糖和雌二醇浓度更高；链脲佐菌素诱发的糖尿病中血清钙镁浓度显著高于对照组，牙齿钙含量有下降趋势，通过影响牙齿硬组织的矿物组成而诱发和加剧龋齿。Nakahara 等［35，36］研究了四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的牙周病病况，病理学检查大鼠的牙龈炎、边缘性牙周炎、牙槽骨吸收情况，发现在糖尿病大鼠中，牙周炎症的发展与邻近龋齿的严重程度密切相关，并且边缘牙周炎常常与牙周炎相连。

在儿童早期龋病中，牙菌斑生物膜微生物学研究发现，大量的变形链球菌下会出现白色念珠菌，相反的无变形链球菌也能偶尔检测到白色链球菌［37－39］。Falsetta等［40］在大鼠口腔模型中，植入变形链球菌，部分再植入白色链球菌，实验结束后进行微生物分析，发现共感染的动物在斑块生物膜内显示出比单独感染任何物种的动物更高水平的感染和微生物携带，而且共感染会增强生物膜的毒性，加重龋齿严重程度。

目前商业化的含葡聚糖酶漱口液中加入的葡聚糖酶主要来自真菌。然而，当用于人类口腔时，细菌葡聚糖酶被认为在口腔温度（约35.5℃）下更加稳定和有效，并且适合于工业应用作为龋齿防止剂［41，42］。 Jiao 等［43］使用来自海洋节杆菌的葡聚糖酶（Dex410），通过动物体内实验发现，在短时间内（1.5个月）Dex410和普通漱口剂Biotene均对龋齿有明显的抑制作用；而对于长期使用 （3个月），只有Dex410对龋齿具有明显的抑制作用。

Eshqhi等［44］研究含铁食物对龋齿的作用，通过对大鼠饲养不同种类的饲料，在偏光显微镜下观察牙齿，发现与不含铁补充剂的致龋食物相比，接受含铁补充剂和致龋食物的组中的龋明显较少。