成都麻羊冷冻精液的制作程序

杨舒慧 ，周光明 ，王小强 ，张麟 ，李芬 ，吴永建

（1.四川省畜牧总站，四川 成都 610041；2.成都市西岭雪农业开发有限公司，四川 大邑 611338；3.成都汇丰动物育种有限公司，四川 成都 610066；4.四川省大邑县安仁都市现代农业产业园管委会，四川 大邑 611331）

成都麻羊，亦称四川铜羊，是一种肉皮兼用型优良地方品种，2014年入选《国家级畜禽遗传资源保护名录》。近年来，成都麻羊能繁母羊的存栏量逐渐下降，故亟需对成都麻羊遗传资源进行保护。而开展冷冻精液的研制工作，将使成都麻羊的遗传物质得到长期而低成本的保存。本文按照国家标准“GB 20557-2006山羊冷冻精液”规定程序，对成都麻羊冷冻精液的制作程序进行了实际探索。

1 精液来源

1.1 种公羊选择 在成都市西岭雪开发有限公司挑选体型外貌和生产性能符合品种要求的特级、一级种公羊12只。对每只公羊进行检疫，确认无传染病，体质健壮。

1.2 种公羊饲养 为了提高采精量、精子活力，保证精子质量，应提前30d加强种公羊的饲养管理。要求饲料营养价值高，容易消化，适口性好。

1.3 种公羊管理 种公羊需保持中上等膘情，健壮、活泼、精力充沛、性欲旺盛，过肥过瘦都不利采精。公羊必须单独组群、饲喂，每日应有足够的运动，运动时间以4～6h为宜。

2 采精准备

2.1 实验室卫生要求 保持实验室清洁卫生、无灰尘，无直射阳光，无蚊蝇，无刺激性气味，室温维持在25℃左右。进入实验室的工作人员需换上干净的工作服、鞋、帽，并佩戴一次性无菌手套。

2.2 实验器材 采精：台羊保定架、羊用假阴道、集精管、凡士林（或石蜡油等）、水浴锅、温度计、烧杯。

检验：恒温载物台、显微镜、盖玻片、载玻片、擦镜纸、微量移液枪、卫生纸等。

稀释：稀释液原料（果糖、柠檬酸钠、甘油、鸡蛋、青霉素、链霉素），电子天平、三角烧杯、量筒、注射器、磁力搅拌器、滤纸、称量纸等。

冷冻：泡沫箱、液氮、超低温冷冻仪、细管、封口粉、脱脂棉、镊子、细管支架、纱布袋等。

2.3 器械消毒 锥形瓶、烧杯、集精管等采用高温干燥箱消毒；量筒、温度计等洗净晾干后，用紫外线照射30min消毒。

3 采精操作

参照《山羊人工授精技术操作规程》中的采精方法，采用手握法采精，取浓稠部分，显微镜下检查精子活力。鲜精活力要求不低于0.65，精子畸形率不能超过15%。检查活力时应先于37℃预热载玻片和盖玻片。

4 精液稀释

4.1 冷冻稀释液配制 基础液：柠檬酸钠2g、果糖4.8g、双蒸水85mL。要求药品纯净、称量标准、瓶装密封，消毒后保存。

I液：基础液85 mL，卵黄15 mL。稀释液每100mL中加入青霉素、链霉素各10万单位。

Ⅱ液：I液中加入8%的甘油（抗冻剂）即得，用作精液第二次稀释。

基础液可多次使用，稀释液需现配现用。

4.2 精液稀释方法

4.2.1 鲜精镜检合格后尽快在5min内用I液作第一次稀释，要把稀释液加温到28～32℃，和精液温度保持一致，稀释比例应根据精液的品质作1～3倍稀释。

4.2.2 稀释后的精液经20～30 min缓慢降温，至2℃左右平衡2～3h，再加入等温Ⅱ液，加入量为第一次稀释比例的一半。第二次稀释前应对精液进行镜检，活力过低者废弃，如活力下降需根据情况降低稀释倍数。

5 精液平衡

将稀释后的精液放在4℃陈列柜中平衡，等温度降到4℃以下再分装。

6 分装

分装前将精液上下轻轻颠倒几次，以保证精液密度、活力均匀。分装时使用0.25mL细管，通过人工吸取或使用注射器将稀释后的精液注入细管，并用聚乙烯醇粉快速密封管口，然后将细管均匀置于冷冻支架上。精液装管时需保证细管内有1.5cm的空气，以防冷冻后爆管。

7 精液冷冻

将液氮倒入有盖的平底器皿中（本实验使用泡沫盒），再放入冷冻支架，距离液氮面3 cm，并保证支架的水平温度在-155～-165℃之间，熏蒸8～10min，冷冻后装入液氮罐。

8 总结

本次成都麻羊冻精制作总耗时5个月，制作周期为每周两次。采集12只种公羊的精液，共包含八个血缘。公羊采精量平均为0.91mL，鲜精活力平均值为0.63，总共制作了3104支细管冻精。每支细管冻精精液量均在0.2mL以上，解冻活力均在0.3以上，前进运动精子数均在3000万以上，符合国家标准，效果良好。

通过本次冻精制作，我们发现冻精质量与操作过程中的各个环节紧密相连，对温度和时间的掌控尤为重要。在精液检测环节，一定要注意加强对恒温载物台的使用，使用的载玻片、盖玻片等需要提前放置在恒温载物台上预热。平衡环节一定要缓慢降温，切忌降温过快对精液造成冷打击，影响精液质量。