自噬相关基因Beclin-1在间歇期痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达变化及意义

杨其彬，何泳龙，青玉凤，李玲琴，谢文光，周京国

(1川北医学院附属医院，四川南充637000；2成都医学院第一附属医院)

自噬是真核生物普遍存在的自稳机制，在胚胎发育、细胞自我保护和生存等过程中发挥关键作用。研究显示，自噬途径及其蛋白在免疫和炎症中有重要作用，细胞自噬的缺陷或自噬相关蛋白的变异与炎症性疾病的发生有密切关联[1,2]。近年来，痛风患病率在世界范围内呈逐年上升趋势[3]，但其发病机制尚未完全明确。研究发现，尿酸盐晶体(MSU)刺激核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎性体活化伴随自噬活性增加[4]；自噬又可通过直接或间接作用负调控炎性体，限制炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)的产生。提示自噬在控制痛风炎症反应过程中起重要作用。Beclin-1是酵母自噬相关基因(ATG)6的同系物，是第1个确定的哺乳动物自噬基因产物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，其编码的Beclin-1蛋白通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)形成复合体来调节其他ATG蛋白在自噬前体结构中的定位，调节自噬活性[5]。Beclin-1参与自噬早期过程，促进自噬小泡的成核和从细胞溶质招募蛋白质。Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，说明Beclin-1是自噬的调控基因[6]。目前尚无痛风患者的自噬研究。本文观察间歇期痛风性关节炎(IGA)患者外周血单个核细胞(PBMC)中自噬相关基因Beclin-1表达变化，并通过自噬功能干预，探讨自噬在IGA炎症过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2013年9月～2014年5月川北医学院附属医院风湿血液科收治的间歇期IGA患者(IGA组)40例，均为男性，年龄24～67(44±12)岁，病程(11±6)年；IGA纳入标准为急性发作期[9]后至少2周，血沉、CRP炎症指标正常，排除有痛风石形成、尿酸盐肾病及尿酸性尿路结石的患者。同期选择体检健康男性80例作为正常对照组，年龄23～65(46±11)岁，均无痛风家族史、心脑血管病史、感染等炎症疾病，实验室指标检查无异常。IGA患者与对照者年龄具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，参与者均知情同意。

1.2 单个核细胞(PBMC)分离及培养 取IGA患者及健康对照者外周静脉血3 mL，肝素钠抗凝。用人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)无菌分离外周血PBMC。

1.3 PBMC中Beclin-1 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR技术。用TRIzol试剂(Invitrogen公司)，依据说明书提取PBMC总RNA，加入无RNA酶水30 μL溶解RNA。取RNA样品5 μL电泳，在1.0%琼脂糖凝胶图谱中显示三条带。紫外分光光度计检测RNA在波长260、280 nm处吸光度(A)值，并计算A260/A280(1.8～2.0者采用)。cDNA的合成按逆转录试剂说明书操作，条件为42 ℃ 45 min终止反应。反转录体系60 μL：RNase Free H2O 24 μL、5×RT Buffer 12 μL、dNTP Mixture 6 μL、Super-RI 1.5 μL、RT-Enhancer 1.5 μL、Random Primer 3 μL、总RNA 9 μL、ReverTra Ace 3 μL。产物cDNA冻存于-20 ℃备用。将cDNA于荧光定量PCR仪上检测，建立总体积为25 μL的反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，USA)12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、双蒸水8.5 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。每份标本均作复孔，复孔间的Ct值差异控制在0.5以内。扩增均在ABI 7900 Real-Time PCR仪(ABI公司，USA)上进行。反应结束后作溶解曲线。以目的基因Ct值-内参Ct值为△Ct，用2-△△Ct计算目的基因相对表达量。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，beclin-1上游引物5′-CCGCAAGATAGTGGCAGAA-3′，下游引物5′-CGACCCAGCCTGAAGTTAT-3′，产物长度264 bp；β-actin上游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG -3′，下游引物5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG -3′，产物长度128 bp。

1.4 PBMC中Beclin-1蛋白表达检测 采用Western blotting技术。用细胞裂解液(RIRA)提取PBMC总蛋白，行SDS-PAGE电泳分离后，转膜及封闭，一抗分别为兔抗人Beclin-1(1∶1 000，CST公司)、GAPDH(1∶1 000，北京康为世纪生物科技有限公司)，二抗为山羊抗兔IgG(1∶3 000，北京中杉金桥生物技术有限公司)进行孵育，TBST洗膜，ECL显色，曝光后扫描，使用Image J软件对图像进行分析，以GAPDH作为内参，Beclin-1灰度值/GAPDH灰度值作为蛋白相对表达量。

1.5 自噬功能干预 随机抽取5例IGA患者外周静脉血20 mL，肝素钠抗凝，5 mL/组，分为四组，分别为未刺激组及MSU刺激1、3、6 h组，MSU刺激组加入MSU(终浓度100 g/mL)后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育不同时间后提取PBMC。随机抽取5例IGA患者及5例体检健康者外周静脉血20 mL，均随机分为五组，分别为空白对照组、雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组、E64d+pepstatin A组。空白对照组不做干预，其他各组均加入MSU干预(MSU终浓度100 g/mL)，同时雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组、E64d+pepstatin A组分别加入自噬激动剂雷帕霉素(终浓度为25 nmol/L)、抑制剂3-甲基腺嘌呤(终浓度为5 mmol/L)、巴佛洛霉素A1(终浓度为10 mol/L)、溶酶体蛋白酶抑制剂(E64d+pepstatin A，终浓度均为10 nmol/L)进行干预，干预后静脉血在细胞培养箱中孵育6 h后分离血浆并提取PBMC。用Western blotting技术检测PBMC中Beclin-1蛋白表达，方法同1.4。

1.6 血浆IL-1β水平检测 取1.5中上述IGA患者自噬激动/抑制功能干预实验分离的血浆样本，按照IL-1β试剂(欣博盛)使用说明用酶联免疫吸附试验测定血浆IL-1β水平。

2 结果

2.1 IGA组与正常对照组PBMC中Beclin-1 mRNA表达比较 IGA组、正常对照组PBMC中Beclin-1 mRNA相对表达量分别为0.000 16(0.000 43)、0.000 56(0.000 77)。与正常对照组比较，IGA组Beclin-1 mRNA相对表达量低(P<0.05)。

2.2 IGA组与正常对照组PBMC中Beclin-1蛋白表达比较 IGA组、正常对照组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.54±0.45、1.84±0.68。与正常对照组比较， IGA组Beclin-1蛋白相对表达量低(P<0.05)。

2.3 MSU对IGA患者PBMC中Beclin-1蛋白表达的影响 未刺激组及MSU刺激1、3、6 h组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量分别为1.11±0.37、4.91±2.49、5.94±2.74、0.06±0.02。MSU刺激1、3 h组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量较未刺激组高(P均<0.05)，而MSU刺激6 h组Beclin-1蛋白相对表达量较未刺激组低(P<0.05)。

2.4 MSU联合自噬激动剂/抑制剂对PBMC中Beclin-1蛋白表达的影响 IGA患者：空白对照组、雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组、E64d+pepstatin A组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量分别为1.13±0.25、0.37±0.05、1.65±0.64、0.98±0.27、2.18±0.26。雷帕霉素组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量较空白对照组低(P<0.01)；自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤、巴佛洛霉素A1、E64d+pepstatin A)组较雷帕霉素组高(P均<0.05)，且自噬抑制剂组Beclin-1蛋白相对表达量恢复至空白对照组水平(P均<0.05)，自噬溶酶体抑制剂(E64d+pepA)组的Beclin-1蛋白相对表达量最高(P<0.05)。体检健康者：空白对照组、MSU组、雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组、E64d+pepstatin A组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量分别为1.72±0.06、1.76±0.06、1.72±0.04、0.62±0.04、0.53±0.06、0.88±0.19。空白对照组、MSU组、雷帕霉素组PBMC中Beclin-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)，而自噬抑制剂组Beclin-1蛋白相对表达量较其他组低(P均<0.05)。

2.5 MSU联合自噬激动剂/抑制剂对IGA患者血浆IL-1β水平的影响 空白对照组、MSU组、雷帕霉素组、3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组、E64d+pepstatin A组血浆IL-1β水平分别为(12.50±8.75)、(12 125±2 740)、(19 317±1 594)、(33 855±8 858)、(34 056±5 110)、(33 021±3 879)pg/mL。血浆IL-1β水平比较，MSU、雷帕霉素组较空白对照组高(P均<0.05)，雷帕霉素组较MSU组低(P<0.05)，自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤、巴佛洛霉素A1和E64d+pepstatin A)组较空白对照组、MSU组高(P均<0.05)，自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤组、巴佛洛霉素A1组和E64d+pepstatin A组)组之间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

自噬是参与细胞质内大分子物质和细胞器降解的一种高度保守的生理行为，通过双层膜结构包裹待降解物质形成自噬体，转运其至溶酶体并与之结合形成自噬溶酶体而降解，在维护细胞内环境稳态方面起重要作用[10]。到目前为止，已知自噬的作用过程包括：①由双层膜结构始发；②双层膜结构的扩张延伸；③分化成熟成为自噬小体；④与溶酶体结合形成自噬溶酶体；⑤包裹摄入物质的降解[11]。痛风是典型的炎症性疾病，但目前有关自噬在痛风中的作用研究尚少。体外研究发现，MSU刺激NLRP3炎性体活化伴随自噬活性增加。自噬又可通过直接或间接作用负调控NLRP3炎性体限制炎症因子IL-1β的产生[4]。结合痛风炎症具有自我缓解的临床特点，提示自噬在痛风炎症反应过程中可能具有重要意义。

Beclin-1是自噬的特异性基因。本研究检测IGA患者PBMC中Beclin-1基因和蛋白表达变化，初步探讨自噬在痛风发病机制中的作用。结果显示，与正常对照组比较，IGA组Beclin-1 mRNA及蛋白相对表达量低，提示痛风患者存在自噬异常，自噬可能参与了痛风发生发展。先前的研究[12]结果显示，Beclin-1蛋白表达变化可反映自噬活性。

饥饿是诱导细胞自噬的经典方法之一。研究证实饥饿可诱导胶质瘤细胞发生自噬，自噬进程十分快速，Beclin-1在饥饿诱导后1 h表达上调，3 h达峰值后逐渐下降[12]。本研究结果显示，MSU刺激IGA患者1、3 h后PBMC中Beclin-1蛋白表达升高，而刺激6 h后Beclin-1蛋白表达下降至刺激前水平，该结果与文献[12]报道一致。体外研究表明，使用自噬激动剂雷帕霉素增强自噬后炎症因子IL-1β水平降低，且Beclin-1通过泛素化方式被自噬溶酶体降解[4]。Beclin-1表达降低提示痛风患者存在自噬异常激活，且可能通过自噬溶酶体途径进行降解。为证实这一假设，本研究阻断自噬通路发现，雷帕霉素组Beclin-1蛋白表达较空白对照组低，而自噬抑制剂组Beclin-1蛋白表达较雷帕霉素组高，且阻断自噬溶酶体组的Beclin-1蛋白表达最高，说明Beclin-1进入自噬溶酶体通路且被其降解。同时检测了体检健康者PBMC中Beclin-1蛋白在自噬功能干预下的表达，与痛风患者的表达存在明显差异，进一步支持自噬在痛风炎症调节过程中可能发挥重要作用。

IL-1β是介导痛风炎症最重要的效应因子。本研究检测了血浆IL-1β水平，与MSU组比较，雷帕霉素组血浆IL-1β水平低，而自噬抑制剂组血浆IL-1β水平高。结果证实自噬能抑制痛风炎症反应。结合相关文献[4,12]，上述结果提示在MSU激活自噬过程中，Beclin-1参与自噬途径并最终被自噬溶酶体降解，可见增强自噬能抑制痛风炎症反应。

综上所述，本研究发现痛风患者早期自噬相关基因Beclin-1表达异常，通过自噬功能干预证实Beclin-1参与痛风患者自噬途径并被自噬溶酶体降解，有助于阐明自噬参与痛风炎症反应的机制。