丁酸梭菌的研究与应用

唐 昊，韩奇鹏，张佩华

（ 湖南农业大学 动物科学技术学院，长沙 410128）

1933年日本千叶医科大学宫入近治博士发现丁酸梭菌，又被称为宫入菌、酪酸菌、丁酸梭状芽孢杆菌和酪酸梭菌，是梭菌属、芽孢杆菌科严格厌氧的革兰氏阳性厌氧细菌，可产生一种丁酸，并在培养过滤物中含有少量脂肪酸[1]。具有抑制沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌和促进肠道乳酸菌、双歧杆菌等有益菌生长的整肠作用。

1 丁酸梭菌特征

丁酸梭菌常被发现于健康动物粪便、土壤、自然酸奶和干酪中[2]。菌体一般单个或成对存在，体呈稍弯曲或直杆状，宽0.6～1.2 μm，长3.0～7.0 μm，两段钝圆；芽孢呈椭圆形或圆形，孢子呈次端生或偏心，无孢附属丝和外壁，细胞壁含D、L-二氨基庚二酸和葡萄糖，周身鞭毛，可运动，偶见丝状菌体。菌落表面形态直径1～3 mm，呈稍不规则的圆形，菌落成奶油色或白色。丁酸梭菌能够促进多种碳水化合物发酵生成乙酸、丁酸、淀粉酶、丁醇、维生素和脂肪酶等，并产生大量氢气，菌株广泛用于产氢能源领域。最适生长繁殖温度为25～37℃，可合成自身生长所需的维生素和氨基酸[3]。

2 丁酸梭菌生理功能

2.1 营养作用

丁酸梭菌可产生良好的动物所需的营养素来源或具有辅助消化作用的丁酸、消化酶、氨基酸、B族维生素等营养物质。丁酸梭菌产生辅助动物消化饲料日粮的胞外酶主要有蛋白酶和淀粉酶等，并分泌大量的胞内酶。同时，丁酸梭菌和拜仁梭菌混合可产生果胶裂解酶和果胶甲酯酶，在肠道产生的果胶最终分解为SCFA[4]。丁酸梭菌代谢中产生的VB1、VB2、泛酸和烟酸等，为动物代谢和生长发育提供必需的营养物质，像维生素K和B族维生素不但可以提供营养，还可促进维生素E的吸收。研究表明，丁酸梭菌在37℃厌氧条件下培养24 h后，上清液中叶酸浓度可以达到8.0 mmol·L-1，维生素B12含量为93 pg·mL-1和维生素B2含量可达111.0 ng·mL-1[5]。

2.2 维持肠道菌群平衡

作为调整肠道功能的代表性菌之一的丁酸梭菌，具有促进有益菌定植和繁殖及抑制有害菌生长的特点。丁酸梭菌产生的脂肪酸（乙酸、丁酸）有降低肠道内pH，抑制有害菌附着与繁殖的功能。

有研究将丁酸梭菌分别按不同比例体外混合培养于有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌和有害菌鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌中，结果表明，丁酸梭菌可增强双歧杆菌和乳酸杆菌的繁殖，并一定程度抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌[6]。

同时，张达荣等采用丁酸梭菌制剂服用于有腹泻、便秘症状的患者，结果表明，丁酸梭菌可促进乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的增殖，并抑制肠道内病原菌和腐败菌[7]。

丁酸梭菌调节动物肠道微生态环境的可能机制总结为4点。丁酸梭菌在动物肠道内有竞争营养物质的作用，一定程度抑制有害菌的生长繁殖，并占据肠上皮细胞黏附位点，进而抑制致病微生物黏附生长；丁酸梭菌可分泌分解多聚糖的多糖分解酶，促使肠道有益菌的发酵底物增多，进而促进机体生长、繁殖；短链脂肪酸（SCFA）的大量产生，可促进肠道黏膜修复、肠道pH降低及抑制有害菌生长，并分泌细菌素可以抑制致病菌蛋白质和核酸的合成、降低ATP浓度，促使细胞内K+外流，进而抑制有害菌定植生长；丁酸梭菌可促使细胞壁上的脂磷壁酸可抑制大肠杆菌在肠上皮细胞的黏附作用[8-12]。

2.3 促进生长

丁酸梭菌生长过程中能分泌蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和糖苷酶等多种酶类。研究表明，高产淀粉酶的丁酸梭菌菌株可以在鸡表面粘液中分离得到[8]。分离纯化定植在动物肠道内的丁酸梭菌可产生果胶甲酯酶和魔芋葡甘露聚糖降解酶[13]。而产维生素酶的丁酸梭菌菌株可在土壤腐木和动物粪便的混合物中筛选分离出来[14]。丁酸梭菌产生酶类有助机体对碳水化合物等营养物质的消化吸收，进而促进机体生长。丁酸梭菌饲喂1日龄罗斯肉鸡42 d，发现丁酸梭菌比抗生素更能明显提高肉鸡重量[15]。此外，丁酸梭菌代谢产物丁酸等能修复肠道及促进肠道上皮细胞再生，其合成的各种维生素能维持人体健康。

2.4 免疫功能及抗氧化性

丁酸梭菌可激活机体免疫系统，促使机体免疫力增强，进而维持动物健康。丁酸梭菌的抗炎作用主要是通过激活动物肠道上皮细胞的TLR-2，从而调节NF-κB信号途径分泌促炎因子（TNF-α、IL-6），进而降低机体致病菌的感染。丁酸梭菌喂给肉鸡后，肉鸡血清总蛋白和免疫球蛋白IgM含量都显著提升[15]。同时，丁酸梭菌饲喂仔公鸡，可使仔公鸡的免疫球蛋白含量、IgG蛋白含量、间胸腺指、脾脏指数和血清补体3含量均有一定程度的增加[16]。此外，无菌小鼠口服丁酸梭菌后发现，肠道内IgA蛋白含量升高，但丁酸梭菌灭活后饲喂小鼠，肠道内IgA蛋白含量没有增加，进一步试验表明丁酸梭菌可以使小鼠体内多细胞黏膜免疫系统激活[17]。

研究表明，丁酸梭菌灭活后，可激活小鼠巨噬细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性，且通过诱导产生高滴度的IFN-γ，进而提高小鼠机体免疫功能[18]。同时发现，丁酸梭菌可促进无菌小鼠的肠道免疫和增强抗霍乱毒素的活性[17]。丁酸梭菌可介导体液免疫途径，促使鲇鱼血清和皮肤的溶解酶活性和免疫球蛋白水平增强及血清酚氧化酶和酸性磷酸酶活性[19]。此外，双粪肠球菌可与丁酸梭菌联合使用，增加腹泻儿童的血清抑炎因子IL-10含量，降低促炎因子TNF-α水平[20]。

2.5 抗肿瘤和抗癌

丁酸梭菌对抗肿瘤和抗癌有一定效果。首次发现丁酸梭菌M55具有溶癌活性是在20世纪50年代，并在20世纪70年代得到证实[21]。研究表明，丁酸梭菌代谢产物丁酸可抑制人体内结肠癌细胞及促进结肠癌细胞调亡[22-23]。研究表明，丁酸梭菌发酵产生的上清液可降低结肠癌SW-480细胞的增殖，提高其调亡率，并使其调亡周期阻滞与G0/G1期[24]。丁酸梭菌液体灌入H22肝癌小鼠胃部后发现，丁酸梭菌可抑制肝癌细胞增殖[25]。丁酸梭菌产生的胞外多聚糖对肉瘤起到完全抑制作用[26]。由于丁酸梭菌分泌的激肽酶具有分解激肽的作用，可对癌组织的毛细血管微循环造成一定的破坏，进而促使癌组织坏死，丁酸梭菌分泌丁酸可为肠上皮细胞提供能量和减少肠道致癌物质（亚硝酸胺）的致癌活性。

研究表明，益生菌可以用来预防肿瘤，是治疗肿瘤的一种潜在方法，但没有实例证明。丁酸梭菌可在肿瘤组织中选择性的定植，进而抑制肿瘤细胞的生长[27]。丁酸梭菌既可减少肠道致癌物质的活性和溶癌的作用，还可以作为肿瘤基因治疗载体。为更加有效、精准的治疗肿瘤，可把TNF-α和胞嘧啶氨酶等基因转入丁酸梭菌中，让其在肿瘤细胞中选择性定植[28]。

3 丁酸梭菌培养工艺

3.1 固体发酵培养

固体发酵与液体发酵相比较而言，具有产品分离难、生长难控制、方法不成熟等缺点。但固体发酵投资少、设备与操作简单及其发酵来源广泛（农副产品、淀粉质原料、食品工业下脚料等）和发酵产品益于长时间贮藏运输。研究表明，以豆粕为培养基质，接种14%，30℃发酵72 h后，菌体浓度可达1.08×108cfu·mL-1[29]。此外，麦麸∶豆粕=1∶1优化组合，CaCl2为0.2%，接种72%，37℃发酵72 h，菌体浓度可达2.2×108cfu·mL-1[30]。

3.2 液体深层发酵

目前经常采用的丁酸梭菌发酵方法是液体深层发酵法，此法便于控制氧气含量，因为丁酸梭菌属于厌氧菌。优化培养基的成分多采用响应面法或正交试验。研究表明，为使菌体浓度达到8×108cfu·mL-1，可采用正交实验法优化丁酸梭菌发酵培养基组分（大豆粉20 g·L-1，葡萄糖8.0 g·L-1，啤酒酵母提取物5.0 g·L-1）[31]。同样采用正交实验优化丁酸梭菌最佳培养基组成，使菌体浓度达到4.1×108cfu·mL-1（葡萄糖8.0 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母膏4.0 g·L-1），芽孢转化率达到95%（上述基础上添加MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、K2HPO45 g·L-1、CaCO31 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1）[32]。为使菌体浓度高达10×108cfu·mL-1，利用响应面法优化丁酸梭菌培养基（果胶 5 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、大豆提取物 39.8 g·L-1、酪蛋白 2.0 g·L-1、玉米粉 3.7 g·L-1，NaHCO31.24 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、CaCL20.02 g·L-1[33]。菌体浓度为3×108cfu·mL-1时，采用清液发酵策略，丁酸梭菌优化后的最佳培养基组分（牛肉浸膏15 g·L-1、胰蛋白胨40 g·L-1、葡萄糖34 g·L-1、可溶性淀粉1.0 g·L-1、乙酸钠3.0 g·L-1、NaCl 5.0 g·L-1、初始pH=7.0、酵母浸粉38 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、半胱氨酸 0.5 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1[34]。为得到10×108cfu·mL-1芽孢数，通过响应法和PB实验设计法优化丁酸梭菌发酵培养基（酵母粉6.0 g·L-1、面粉 37.2 g·L-1、米粉 39.6 g·L-1、鱼粉 9.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 19 g·L-1、NaCl 1.9 g·L-1、CaCO34.8 g·L-1、NaHCO30.1 g·L-1、KH2PO40.1 g·L-1）[35]。

4 丁酸梭菌的研究与应用

目前丁酸梭菌主要被应用于体内正常菌群失衡导致的相关疾病治疗，如临床治疗感染性腹泻、炎症性肠病、肠易激综合征等，还应用于畜牧生产过程中。

4.1 临床研究与应用

丁酸梭菌可以显著治疗腹泻、炎症、便秘等疾病，且有极强的整肠作用。研究表明，酪酸梭菌二联活菌散可显著降低婴儿腹泻的发病率[36]。同时，酪酸梭菌二联活菌散可有效治愈溃疡性结肠炎[37]。最先将酪酸菌相关制剂投入商业化临床应用的国家是日本，现已形成多种产品。我国对丁酸梭菌微生态制剂的研究起步较晚，目前国内较常用的酪酸梭菌相关产品包括酪酸梭菌二联活菌散、酪酸梭菌活菌胶囊、口服酪酸梭菌、活菌片和口服酪酸梭菌等。

4.2 丁酸梭菌在动物生产中的研究与应用

4.2.1 增强机体免疫力

在幼龄畜禽的日粮中添加丁酸梭菌可有效提高动物机体免疫功能。研究表明，丁酸梭菌（2×107cfu·kg-1）添加到肉仔鸡的日粮中，可使肉仔鸡血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量显著增加（P＜0.05）[38]。同时，丁酸梭菌对K88大肠杆菌攻毒引起的肉鸡生长性能下降有一定缓解作用，并促进攻毒后肉鸡血清IgM、IgA含量和黏膜sIgA含量增加，进而提高机体免疫能力[39]。

在畜牧业中丁酸梭菌主要应用于饲料添加剂和兽药，可有效提高动物机体抗病原微生物的能力。研究表明，仔鸡服用乳酸菌、酵母菌和酪酸菌复合酪酸菌制剂，结果表明，可以预防大肠杆菌感染（97.5%）、降低大肠杆菌引起的死亡（50%），增加仔鸡体重（8.28%）[40]。以美国红鱼为研究对象，饲喂丁酸梭菌菌粉饲料（1.0×109cfu·g-1），结果表明，丁酸梭菌可显著提高美国红鱼体表粘液溶菌酶活性和血清中补体C3水平及吞噬细胞呼吸爆发活性[41]。

丁酸梭菌可抑制肠道腐败产物的产生，增加肠内短链脂肪酸的生成量，促进动物排便，且抑制有害菌生长，进而在治疗肠道疾病中得到广泛应用。

4.2.2 提高动物生长性能

动物机体的消化吸收功能与肠道隐窝深度和绒毛高度密切相关，丁酸梭菌可改善动物肠道健康，进而提高动物生产性能。研究表明，丁酸梭菌（108cfu·kg-1）可有效提高仔猪平均日增重，降低料重比，降低隐窝深度，增加小肠绒毛长度，进而提高仔猪的消化能力[42]。109cfu·kg-1丁酸梭菌可增加鲶鱼生产性能和降低饲料转化系数[19]。丁酸梭菌还可提高1～24日龄肉鸡平均日增重和日采食量[43]。此外，丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌配伍的复合益生菌可有效提高生长育肥猪的表观消化率和日增重，降低料肉比[44]。

4.2.3 提高动物产品品质

丁酸梭菌除了能促进动物生长外，还可以促进肠道微生物区系稳定，对相关疾病有一定的治疗效果，还可减少动物体内的药物残留。研究表明，肉鸡饲料日粮中添加丁酸梭菌（109cfu·kg-1）和枯草芽孢杆菌（1010cfu·kg-1）的复合益生菌2%，可有效降低肉鸡血清中甘油三酯和胆固醇的含量及胸肌亮度，增加肌肉的感官品质[45]。

同类复合益生菌还对生长育肥猪的大理石纹评分、肉色评分和肌肉红度有一定的提高作用[44]。此外，单独添加丁酸梭菌可显著增加肉鸡腿肌和胸肌的肌内脂肪含量及腿肌的肌纤维直径，还可减少动物脂肪沉积。可能是由于丁酸梭菌的代谢产物和细胞壁成分对动物肠道上皮细胞的血管生成素样蛋白4表达有一定的调节作用。并对脂蛋白脂肪酶活性起到抑制作用，进而阻止甘油三酯的沉积[43]。

5 小结

丁酸梭菌的理化性质具有抵抗外界恶劣环境的作用。体内受消化液、胃酸和胆汁酸影响较小，且对抗生素敏感性较弱[46]。因此丁酸梭菌广泛应用于微生态制剂。此外，丁酸梭菌在饲料添加剂、食品添加剂、人肠炎治疗药物和兽药中有着广泛的应用前景。

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