ERIC-PCR技术在动物流行病学调查中的应用

朱佳文 ，吴永胜 ，许祯莹 ，苏志鹏 ，邱时秀 ，李娟 *

（1.成都市农林科学院畜牧研究所，四川 温江 611130；2.四川特驱投资集团有限公司，四川 双流 610207）

近几年，越来越多的科研工作者开始专注于肠道微生物的研究，ERIC-PCR技术以其操作简单、试验重复性高和分辨力强等优点而被广泛利用。

1 ERIC-PCR技术的背景

ERIC是肠杆菌间保守的重复基因序列，能够同时比较大规模微生物样品的序列结构特征。ERIC序列长为126bp，存在于基因组的转录区域，其序列具有高度保守性，但在不同物种染色体上的定位不同。Hulton等[1]指出ERIC序列存在于许多肠道菌中，而且可以作为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和其他一些肠道微生物新的重复单元家族。同年，Versalovic等[2]发现可以通过ERIC序列设计引物对细菌进行PCR扩增，得到不同细菌基因组的指纹图谱。由于ERICPCR技术能够得到敏感性好和重复性高的ERICPCR指纹图谱，因而该技术逐渐被利用在各种不同的环境微生物生态学研究中，并且取得了较好的结果。

2 ERIC-PCR检测原理及优缺点

ERIC-PCR原理是根据ERIC核心序列（44bp）设计引物进行PCR扩增，Versalovic等[2]早在1991年便设计了一对反向引物（ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCT GGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3′），用于扩增两个相邻的ERIC保守序列之间的区域，由于不同细菌基因组上ERIC重复序列的数目和分布不同，得到的DNA指纹图谱也不同，扩增产物的大小在50～3000bp之间，根据电泳带上不同的DNA片段可以分析菌种类型。

相对于其他分子流行病学分型方法，ERIC-PCR具有操作简单、灵敏度高、重复性好的优点。ERICPCR技术能够有效区分细菌菌株间的差异性，在流行病学调查中具有重要价值。虽然ERIC-PCR技术是一种有效的细菌基因分型方法，但仍存在不足。若想得到更好的图谱丰度和准确性则需要不断地优化条件或结合其他方法共同检测。潘康成等[3]于2010年分别利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术对肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后的肠道菌群多样性进行研究，虽然两种方法的结果均显示饲喂枯草芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道微生物的丰度和种群密度，但从指纹图谱和统计条带数量上看，PCR-DGGE技术更优于ERIC-PCR技术。

3 ERIC-PCR在动物流行病学调查中的应用

3.1 ERIC-PCR在监测动物肠道微生物多样性上的应用 动物肠道微生物在机体发育、免疫、营养物质代谢和疾病发生等方面都有非常重要的作用，而ERIC-PCR作为一种快速有效的分析肠道微生物菌群结构和动态平衡的分子生物学手段已有越来越广泛的应用。2005年，鲁海峰等[4]抽提大熊猫粪便样品中的微生物总DNA，并以此为模板进行ERIC-PCR扩增和Southern杂交，比较了各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果发现大熊猫不同个体间的肠道微生物群落结构比较相似，同一个体不同时期稳定性较高，但当个体出现问题时肠道优势菌群结构有一定波动。2011年，杨柳等[5]采用ERIC-PCR与DGGE相结合的方式，分析了荣昌猪肠道微生物群落特征，并与外源品种猪（长白、杜洛克）的肠道微生物群落进行比较，发现母猪哺乳对仔猪肠道微生物的影响明显，且不同品种猪的肠道优势菌差异较大。2013年，崔明全等[6]分析了一只野生大熊猫和不同年龄段圈养大熊猫粪便菌群的多样性和相似性，发现大熊猫的肠道菌群多样性容易受到生长环境、年龄因素的影响，并指出应用ERIC-PCR指纹图谱优势条带鉴定优势菌的方法有一定的局限性。孙杰等[7]采用常规菌群分析方法和ERIC-PCR技术对正常小鼠和抗生素相关性腹泻小鼠进行了肠道菌群的检测，验证了ERIC-PCR技术的准确性，并发现阴性组和对照组肠道菌群的分布状况存在明显差异。

3.2 ERIC-PCR在病原菌分类上的应用 由于ERIC-PCR得到的图谱稳定、重复性高，并能产生多种独特的扩增产物，所以可以将细菌进行分型。1999年，Giovanni等[8]将ERIC-PCR技术应用到混合菌群和BIOLOG革兰氏阴性菌群的群落结构分析上，得到了能够反映菌群组成差异且稳定的指纹图谱。ERIC指纹图谱在李斯特菌种间及单增李斯特菌株间有很好的鉴别能力[9]。李鹏等[10]根据副猪嗜血杆菌15种血清型的特异性ERIC指纹图谱，对中国东南部不同猪场的111株副猪嗜血杆菌样品进行鉴定，得到了23种指纹图谱，发现来自不同地区的分离株，其ERIC指纹图谱也不同，说明副猪嗜血杆菌在中国东南部存在多种基因型，同时验证了ERIC-PCR技术可用于对某一地区的细菌进行分子流行病学研究和基因型鉴定。

3.3 ERIC-PCR在追溯感染源上的应用 ERIC-PCR技术在确定疫病暴发或流行，追溯传染源和控制肠道致病菌中也有非常重要的作用。2013年，宋玉财等[11]利用ERIC-PCR技术对比健康仔猪与黄白痢仔猪的粪样样品图谱，发现健康仔猪粪样与黄白痢仔猪的相比，ERIC-PCR图谱相似性高，而且黄白痢仔猪肠道菌群中至少有一种类型的细菌异常增殖，这可能是造成仔猪黄白痢的原因。朱晓慧等[12]于2016年通过ERIC-PCR扩增比较了健康大鼠和水浸束缚应激大鼠的肠道微生物变化，发现急性应激后大鼠胃部和回肠的特征性条带较少，而盲肠和结肠的特征性条带较多，暗示干预急性应激可以从盲肠和结肠入手。曾波等[13]于2017年构建了不同周龄健康家兔及腹泻家兔肠道微生物的ERIC-PCR指纹图谱，分析二者肠道菌群结构的多样性及其差异性，发现随着家兔周龄的增加，健康家兔的肠道微生物菌群结构和多样性发生了明显变化；腹泻兔与同一周龄的健康兔比较，肠道微生物菌群结构发生改变，多样性降低，并出现了新的优势菌群。这些研究结果为优化家兔饲养和预防疾病打下了基础。

4 小结

综上所述，利用ERIC-PCR分子生物学技术追踪肠道微生物菌群结构特征和监测生物种群动态是一种高效简单的手段，在流行病学调查上具有非常重要的价值。该技术可以从分子水平上对细菌群进行快速的鉴别分类，为人类更好地了解和监测动物肠道微生物稳态提供有力的依据，在探讨微生物和动物健康方面有着广阔的应用前景。

[1]Hulton C S J，Higgins C F，Sharp P M.ERIC sequences：a novel family of repetitive elements in the genomes ofEscherichia coli，Salmonella typhimuriumand other enterobacteria[J].Molecular Microbiology，1991，5（4）：825-834.

[2] Versalovic J，Koeuth T，Lupski R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J].Nucleic Acids research，1991，19（24）：6823-6831.

[3] 潘康成，陈正礼，崔恒敏，等.利用ERIC-PCR和PCRDGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性[J].动物营养学报，2010，22（4）：985-991.

[4] 鲁海峰，魏桂芳，李仲逵，等.ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构[J].中国微生态学杂志，2005，17（2）：81-84.

[5] 杨柳，张邑帆，郑华，等.荣昌、长白、杜洛克猪肠道微生物ERIC-PCR-DGGE指纹图谱比较分析[J].家畜生态学报，2011，32（5）：21-25.

[6] 崔明全，何廷美，钟志军，等.大熊猫粪便菌群ERICPCR指纹图谱的分析及优势菌群的鉴定[J].畜牧与兽医，2013，45（9）：6-11.

[7] 孙杰，孙丽妲，伦永志，等.基于ERIC-PCR指纹图谱技术的小鼠肠道菌群失调分析方法的建立[J].中国微生态学杂志，2016，28（12）：1386-1388.

[8] Di Giovanni G D，Watrud L S，Seidler R J，et al.Fingerprinting of mixed bacterial strains and BIOLOG Gram-Negative（GN） substrate communities by enterobacterialrepetitive intergenic consensus sequence-PCR（ERIC-PCR）[J].Current Microbiology，1999，38（4）：217-223.

[9] 金莉莉，王秋雨，侯潇.ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的应用[J].遗传，2003，25（2）：195-197.

[10] 李鹏，李军星，李玉峰，等.中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析[J].中国兽医学报，2009，29（12）：1566-1570.

[11] 宋玉财，王彬，王俊卿，等.健康仔猪与黄白痢仔猪肠道菌群结构分析[J].湖北畜牧兽医，2013，34（2）：21-22.

[12] 朱晓慧，张成岗，刘海峰.急性应激后大鼠胃肠道病理变化及其菌群ERIC-PCR图谱分析[J].生物技术进展，2016，6（3）：200-205.

[13] 曾波，张智，李再新.家兔肠道微生物ERIC-PCR指纹图谱构建及分析[J].南方农业学报，2017，48（1）：139-143.