1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)与膜性肾病

张昌明 综述 刘志红 审校

膜性肾病(MN)是一种原因不明的自身免疫性疾病，其病理特征表现为肾小球毛细血管基膜上皮侧免疫复合物沉积，寻找MN致病抗原一直是本领域的核心研究工作。MN的诊断需排除系统性红斑狼疮、肿瘤、感染等疾病导致的肾小球膜性病变。2009年，Beck等[1]发现M型磷脂酶A2受体(PLA2R)是多数MN患者特异性致病靶抗原。该研究发现约70%的MN患者血清中存在针对PLA2R的自身抗体[1]。后续系列研究发现PLA2R抗原或抗体可以作为MN患者疾病诊断、监测和预测预后的新型标志物[2-4]，也可用于指导MN患者个体化治疗方案的选择。但仍有少部分MN患者表现为PLA2R阴性。2014年，Tomas等[5]发现PLA2R抗体阴性的MN患者存在另一特异性致病靶抗原1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)，其在MN患者中阳性率约为3%。本文就THSA7A及其抗体在MN中的作用作简要综述。

THSD7A抗体的发现

2014年，Tomas等[5]利用MN患者血清和正常肾小球提取物在非还原状态下行免疫印迹实验，发现一条分子量约为250 kD的条带，质谱分析和重组抗原抗体试验证实该条带对应的抗原为THSD7A。在154例PLA2R抗体阴性MN患者中发现15例血清中存在针对THSD7A的自身抗体，而在其他肾小球疾病如局灶节段性肾小球硬化、微小病变肾病和健康人血清中均未找到该抗体，提示THSD7A抗体是MN的特异性表现。

THSD7A是一种I型跨膜蛋白，由1657个氨基酸构成，分子量约250 kD，从氨基端到羧基端依次为氨基末端信号肽(47个氨基酸)、22个凝血酶敏感蛋白1型重复序列(TSR，含14个糖基化位点)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模序、跨膜区和短小的胞内尾段[5]。THSD7A表达于胎盘脉管系统、脐静脉内皮细胞、神经元细胞等，参与内皮细胞迁移、血管生成、神经系统发育等生理过程[6-8]。全基因组关联分析证实THSD7A基因单核苷酸多态性和肥胖及骨质疏松症相关[9-10]。THSD7A胞外段可以被剪切形成可溶性THSD7A，通过黏附斑激酶(FAK)依赖的方式调节内皮细胞迁移和血管生成[11]。Tomas等[5]对肾活检样本进行免疫荧光染色，发现THSD7A 与足细胞足突或其附近的nephrin共定位，而不与基底膜标志物Ⅳ型胶原和纤连蛋白共定位，也不与内皮细胞标志物CD34共定位，提示THSD7A表达于足细胞足突而不是基膜或内皮细胞，这与PLA2R主要定位在足细胞膜表面类似。采用morpholino技术敲除斑马鱼幼鱼足细胞THSD7A后，出现明显的水肿、包囊扩张、足细胞数目减少、nephrin表达减少及足突融合，表明THSD7A对于维持足细胞正常功能和肾小球滤过膜完整性具有重要作用[12]。同PLA2R抗体相似，THSD7A抗体以IgG4亚型为主，仅识别非还原状态下的THSD7A 抗原，提示抗体识别的是一种依赖于链间二硫键结构的空间表位，推测该表位可能仅存在于某一种特定的空间结构中[5]。

THSD7A抗体的致病机制

与PLA2R不同，THSD7A不仅表达于人类足细胞，而且表达于啮齿类动物的足细胞，这使得人们能利用动物模型更好的研究THSD7A抗体导致MN的分子机制[13-14]。Tomas等[15]将THSD7A抗体阳性MN患者血清注射给小鼠，发现人THSD7A抗体能特异性的结合小鼠足细胞上的THSD7A，该抗体亚型为IgG4、与nephrin及THSD7A共定位；注射后3d小鼠即出现蛋白尿，并可持续至70d；病理形态上可观察到IgG、C3在肾小球基膜上皮侧成颗粒状沉积，超微结构可观察到上皮下的电子致密物沉积和足突增宽，少数部位可观察到足突融合。这些结果表明THSD7A抗体通过结合足细胞足突表面的THSD7A抗原，形成免疫复合物以激活补体系统，损伤足细胞，破坏肾小球滤过屏障，从而导致机体产生蛋白尿和MN的病理学改变[15]。同时研究者将THSD7A抗体从患者血清中纯化出来，再注射给小鼠也发现了相似的结果，进一步证明THSD7A抗体是导致小鼠蛋白尿和MN的原因[15]。研究者进一步制备了小鼠原代培养足细胞(GECs)并证实GECs表达THSD7A和足细胞特异性蛋白α-actinin-4。将THSD7A抗体与GECs孵育，发现THSD7A抗体可与GECs上的THSD7A特异性结合，通过改变GECs细胞骨架(形成应力纤维和增强F-actin表达)和黏着斑结构(磷酸化的paxillin表达增强，并从细胞边缘向细胞中心移动)，导致GECs形态改变并从培养板脱落，表明THSD7A抗体通过直接影响细胞骨架重组而导致足细胞损伤[15]。

THSD7A的临床应用价值

THSD7A抗体与MN诊断目前对THSD7A抗体的研究资料较少，初步结果显示该抗体在MN诊断和鉴别诊断方面有如下作用：(1)帮助鉴别MN与其他肾小球疾病。在正常人群和非MN的肾小球疾病中尚未检出THSD7A抗体[5,16-17]。在成人MN中，THSD7A抗体阳性率为1.4%～3.1%(表1)。Hoxha等[17]在一个前瞻性的MN队列(345例)中发现8例THSD7A抗体阳性(2.3%)，其中PLA2R抗体阴性的患者THSD7A抗体阳性率为9.0%；回顾性的MN队列(931例)中发现28例THSD7A抗体阳性(3.0%)，其中PLA2R抗体阴性的患者THSD7A抗体阳性率为3.5%～12.4%。Wang等[17]在578例中国MN患者中发现8例THSD7A抗体阳性(1.4%)，其中PLA2R抗体阴性的患者THSD7A抗体阳性率为9.4%；(2)帮助鉴别特发性MN (IMN)与继发性MN(SMN)。Tomas等[5]在483例IMN患者血清中发现15例THSD7A抗体阳性(3.1%)，67例SMN患者中发现2例THSD7A抗体阳性(3.0%)，但这2例患者肾脏病理上未见SMN的表现，肾组织IgG亚型也以IgG4为主，很可能是MN和其他疾病(系统性红斑狼疮和肿瘤)共存。Wang等[17]在114例SMN中发现1例THSD7A抗体阳性(0.9%)。由于目前研究的病例数较少，该抗体帮助鉴别IMN和SMN的结论有待进一步证实。

THSD7A抗体与MN预后初步研究结果表明血清THSD7A抗体与MN疾病活动性相关[5,16-17]。Tomas等[5]报道2例大量蛋白尿的MN患者，免疫抑制剂治疗后随着THSD7A抗体水平下降，蛋白尿水平下降，而另一例患者持续高水平的THSD7A抗体则伴随着持续大量蛋白尿。Hoxha等[16]对11例血清THSD7A抗体阳性的患者进行了至少1年的随访，发现1例患者在9个月时进入ESRD，5例THSD7A抗体转阴的患者中4例达到完全缓解，1例部分缓解，而5例THSD7A抗体持续阳性的患者蛋白尿仅部分缓解或无缓解。Wang等[17]发现2例THSD7A抗体阳性的MN患者达到完全缓解时该抗体转阴，而蛋白尿复发时该抗体再次出现。但是THSD7A抗体滴度与蛋白尿程度并不相关，也不能预测MN的治疗反应。Sharma等[18]发现10例THSD7A抗体滴度1∶ 10的患者平均蛋白尿为10.1 g/d(范围2.8～23 g/d)，9例有随访的患者中仅1例蛋白尿部分缓解，其余均无缓解；11例抗体滴度1∶ 100的患者平均蛋白尿为10.5 g/d(范围3～15 g/d)，7例有随访的患者中2例完全缓解，2例部分缓解，其余3例无缓解；3例抗体滴度1∶ 500的患者平均蛋白尿为9.2 g/d(范围2.4～15.9 g/d)，治疗后均无缓解。以上研究结果提示THSD7A抗体与MN预后相关，但仍需前瞻性、大样本的临床研究来证实。

THSD7A抗体与MN移植后复发血清THSD7A抗体水平还与MN移植后复发概率有关。2016年，《Journal of Clinical Investigation》杂志报道了一例因MN进展至ESRD而行肾移植的老年男性患者，回顾检测其移植前血清标本发现高滴度THSD7A抗体、肾小球THSD7A染色阳性，而血清PLA2R抗体及肾小球PLA2R染色均阴性；移植后1年再次出现大量蛋白尿，行移植肾活检提示MN复发，肾小球THSD7A染色阳性而PLA2R染色阴性，血清THSD7A抗体也呈现高滴度阳性，而PLA2R抗体阴性，提示血清THSD7A抗体水平可以帮助预测MN患者移植后复发风险，具有高滴度THSD7A抗体者可能需要更加积极的免疫抑制治疗[15]。

肾小球THSD7A表达与MN THSD7A抗原存在于MN患者肾小球上皮侧免疫复合物中，血清中未检出游离的THSD7A抗原或者THSD7A-THSD7A抗体免疫复合物，证实肾小球上皮侧的免疫复合物为原位形成[5]。在正常人肾小球仅能观察到微量的线性分布的THSD7A信号，在MN患者中则能观察到沿血管袢分布的颗粒状THSD7A染色增强[5,15]。同PLA2R相关性MN相似[3,19-20]，肾小球免疫复合物中THSD7A染色和血清THSD7A抗体之间并不是完全平行的关系。部分血清THSD7A抗体阴性的患者，仍然可以观察到肾小球THSD7A染色特异性增强，表明肾组织THSD7A染色比血清THSD7A抗体水平检测具有更高的敏感度，可提高THSD7A相关性MN患者的诊断精确度[16,21]。

MN患者肾组织THSD7A染色阳性率见表1。Hoxha等[16]在65例未使用免疫抑制剂治疗的MN患者中发现7例THSD7A染色阳性(10.8%)。Wang等[17]在578例中国MN患者中发现12例THSD7A染色阳性(2.1%)，其中2例THSD7A/PLA2R双阳性(0.3%)；64例PLA2R染色阴性的患者中有10例THSD7A染色阳性(15.6%)。Lin等[21]在136例MN患者中发现5例THSD7A染色阳性(3.7%)，其中3例血清THSD7A抗体也是阳性的。Sharma等[18]在1 318例MN患者中发现31例THSD7A染色阳性(2.4%)。Larsen等[22]在258例MN患者中发现9例THSD7A染色阳性(3.5%)，其中2例THSD7A/PLA2R双阳性(0.8%)。Iwakura等[23]在55例日本MN患者中发现5例THSD7A染色阳性(9.1%)，而37例SMN患者中THSD7A染色均阴性。Qin等[3]在53例血清PLA2R抗体及肾组织PLA2R染色均阴性的MN患者中发现4例THSD7A染色阳性(7.5%)。

THSD7A相关性MN的特点

THSD7A被发现后，不断有学者将THSD7A抗原或抗体阳性的MN统称为THSD7A相关性MN[5,16,22,25]。与PLA2R相关性MN相比，THSD7A相关性MN患者中女性比例更高(57%)，而年龄、蛋白尿、估算的肾小球滤过率或血清肌酐水平相当[5,16]。值得注意的是，约有20%的THSD7A相关性MN患者在随访过程中(中位随访时间3个月)被检出患有恶性肿瘤[16]。而经过肿瘤切除、化疗后随着血清THSD7A抗体水平下降，蛋白尿水平亦下降[26]。与不伴肿瘤的患者相比，伴有肿瘤的THSD7A相关性MN患者肾小球炎症细胞浸润更多，而IgG4阳性率及其他病理学表现两者无差异[16]。据此研究者提出了一种新的理论：免疫系统识别肿瘤组织的THSD7A而产生THSD7A抗体，后者与足细胞THSD7A结合而形成原位免疫复合物，导致MN发生[16]。之后Lin等[27]报道了一例THSD7A相关性MN伴1型神经纤维瘤的病例。然而近期发表的两项研究结果则与此不同。Sharma等[18]观察了31例THSD7A相关性MN的临床病理特点，发现THSD7A相关性MN以男性为主(61%)，肿瘤发生率仅为6%，均发生于MN诊断之前，在平均12个月的随访过程中没有发现恶性肿瘤。Wang等[17]对12例THSD7A相关性MN患者进行了严密的肿瘤筛查，在平均23个月的随访过程中也没有发现恶性肿瘤。这种差异存在的原因尚不明确。尽管如此，这一现象仍值得我们关注，提醒我们对THSD7A相关性MN患者要进行周密的肿瘤筛查。

THSD7A：1型血小板反应蛋白7A域；WB：免疫印记法；IFT：间接免疫荧光法；IHC：免疫组化；IF：免疫荧光；IMN：特发性膜性肾病；SMN：继发性膜性肾病；IS：免疫抑制剂；PLA2R：磷脂酶A2受体

THSD7A相关性MN研究方法进展

血清THSD7A抗体的检测方法包括：免疫印迹法(WB)和间接免疫荧光法(IFT)。WB法结果可靠，但是操作步骤繁琐，不适用于大样本高通量的临床研究。与WB法相比，IFT法操作简单，特异性为100%，敏感性为92%[16]，但尚不能够准确定量，且受观察者主观性的影响[28-29]。酶联免疫吸附试验(ELISA)法操作简便快速，能够进行精确定量，检测结果不受检查者主观性的影响，与WB和IFT法具有相似的敏感性和特异性，是多种血清抗体理想的检测方法[30-31]，但目前尚无商品化的血清THSD7A抗体ELISA检测试剂盒用于研究抗体水平和临床指标及预后之间的关系[32]。肾组织THSD7A的检测方法包括免疫组化法(IHC)和免疫荧光法(IF)，其中IHC方法使用较多。

如前文所述，MN患者THSD7A抗体检出率不高，使得人们很难得到足够的THSD7A抗体阳性血清用于更深入系统的研究。为解决这一问题，Tomas等[12]制备了兔抗人THSD7A抗体，并证实该抗体能诱导BALB/c小鼠产生MN，从而建立了一种异源性的小鼠THSD7A相关性MN模型。该模型可帮助人们进一步研究MN分子机制并寻找新的治疗策略。此外该抗体能与C57BL/6、DBA/J1小鼠和Sprague-Dawley大鼠的肾小球滤过膜结合，但并不能诱导蛋白尿，表明遗传背景在该模型中具有重要作用。

小结：随着MN致病靶抗原的不断发现，IMN这一名词不断受到挑战，逐渐被PLA2R相关性MN，THSD7A相关性MN，靶抗原不明的MN和SMN所取代[25,33]。THSD7A抗体和抗原检测在MN中的作用的研究较少，但有限的研究结果已显示出其在MN诊断、预后判断和病情监测等方面的潜在应用价值。值得注意的是THSD7A相关性MN患者肿瘤发生率较高，后续需大样本的研究验证这一现象。动物模型、足细胞损伤模型和商品化的血清THSD7A抗体检测试剂盒的面世有助于更深入、高效的阐明THSD7A在足细胞中的功能，以帮助我们更好地理解MN的发病机制及制定对应的治疗方案。

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