低内毒素蔗糖细菌内毒素检查方法的建立

罗莉娅，苟立平，邓星，陈英杰，万丽

蔗糖是一种从甘蔗、甜菜和其他来源中获得的糖，为无色结晶或白色结晶性的松散粉末，无臭，味甜。蔗糖是一种广泛使用的药用辅料，可在口服制剂中作黏合剂、矫味剂，在冻干蛋白产品中作稀释剂，在冻干注射剂中作冻干赋形剂等[1]。基于低内毒素蔗糖可用于注射剂的制备，本文根据2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”项下凝胶法的要求[2]，建立了低内毒素蔗糖细菌内毒素的检查方法。

1 材料

1.1 仪器

BET-32型细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；ZH-2自动漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）；SEG-021H高温试验箱（上海爱斯佩克环境设备有限公司）。试验用试管、刻度吸管等玻璃器材按药典规定，于250 ℃下，干热灭菌1 h，去除外源性内毒素。

1.2 药品与试剂

低内毒素蔗糖（厂家：德国Merck，批号：K47396392610、K47390298692、K47396398614规格：50 kg/袋）；鲎试剂[湛江安度斯生物有限公司，批号：1612191，灵敏度（λ）：0.125 EU﹒mL-1，规格：0.1 mL/支；福州新北生化工业有限公司，批号：16061212，灵敏度（λ）：0.125 EU﹒mL-1，规格：0.1 mL/支]；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-201681，规格：80 EU/支）；细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，批号：1609200，规格：50 mL/瓶）

2 方法与结果

2.1 样品细菌内毒素限值（L）的确定

在欧洲药典中，按规定的公式L=K/M计算，当蔗糖用于大容量注射用药物的制备时，其内毒素需≤0.25 EU﹒mg-1[3]。式中K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，M为人用每千克体重每小时的最大样品剂量。与此同时，参照厂家提供的低内毒素蔗糖的要求，故将低内毒素蔗糖细菌内毒素限值定为1 EU﹒g-1。

2.2 供试品最小有效稀释质量浓度（c）的确定

按2015年版《中国药典》细菌内毒素检查规定，MVD=cL/λ，L为细菌内毒素限值，λ为TAL的标示灵敏度。最小有效稀释浓度为c=λ/L=(0.125 EU﹒mL-1)/ (0.001 EU﹒mg-1) =125 mg﹒mL-1。

2.3 TAL灵敏度复核

按照2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”规定，进行TAL的灵敏度复核。根据TAL的λ=0.125 EU﹒mL-1，用BET水溶解细菌内毒素工作标准品，在旋涡混合器上混匀15分钟，配制成2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ四种浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟，每个浓度平行4管；另外2管加入BET水作为阴性对照管。取2批不同厂家的TAL分别进行试验，结果TAL灵敏度测试值（λ）均在0.5 λ～2.0 λ之间，符合规定，可以用于细菌内毒素检查试验，结果见表1（注：“+”表示试剂形成凝胶且倒转不变形或滑落，即反应呈阳性；“-”表示未形成凝胶不结实、变形并脱落，即反应呈阴性。以下各表同）。

表1 TAL的灵敏度复核试验结果

2.4 干扰预试验

称取供试品（批号: K47396392610）约20 g，用BET水稀释制成浓度分别为375、250、150、125 mg﹒mL-1的系列溶液，标记为供试品阴性对照管（NPC系列，各2管）；用上述系列溶液作为溶剂，分别溶解并稀释CSE，制得细菌内毒素含量均为2.0 λ的供试品阳性对照管（PPC系列，各2管）；同时做细菌内毒素阳性对照管（PC）和BET水阴性对照溶液（NC），各2管，然后按“细菌内毒素检查法”操作，进行干扰预试验，结果见表2。由表2结果可知，供试品稀释至150 mg﹒mL-1时，2批λ为0.125 EU﹒mL-1的TAL对细菌内毒素检查试验均无干扰作用。

表2 样品干扰预试验结果

2.5 干扰试验

根据预干扰试验结果，取3个批号的低内毒素蔗糖，用BET水稀释成150 mg﹒mL-1的样品溶液。用BET水和此浓度的稀释液分别将同一支细菌内毒素工作标准品稀释成含细菌内毒素2.0、1.0、0.5、0.25 λ四种系列溶液，每个浓度平行4管。另取细菌内毒素检查用水和此浓度的稀释液各做2支，作为阴性对照管。用2批TAL，按2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”的规定进行干扰试验，结果见表3。结果显示，用BET水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）均在0.5 λ ～2.0 λ之间，此浓度稀释液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）均在0.5 Es ～2.0 Es之间，此时供试品对TAL与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用。

表3 样品干扰试验结果

2.6 样品细菌内毒素检查

取3批供试品各适量，用BET水制成含维生素E质量浓度为150 mg﹒mL-1的供试品溶液，分别用2批λ为0.125 EU﹒mL-1的TAL，按2015年版《中国药典》（四部）通则1143“细菌内毒素检查法”进行试验，按要求做阳性（PPC、PC）、阴性（NPC、NC）对照，结果见表4。结果显示3批供试品每1 g中含细菌内毒素的量均小于1 EU。

表4 样品干扰预试验结果

3 讨论

本实验利用鲎试剂来检测由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断低内毒素蔗糖中细菌内毒素的限量是否符合规定，而本法则是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行试验。现行世界各国药典以及国际药典对此方法均有收载，其具有操作简单、检测周期短、灵敏度高、结果准确等优点[4-6]。建立内毒素检查法时进行干扰试验，目的是评价样品质量浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度，初步筛选出对细菌内毒素检查无干扰的样品质量浓度范围[7]。不同厂家生产的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面存在一定的不同，其抗干扰能力存在差异，故本试验采用2个不同厂家的鲎试剂（λ= 0.125 EU﹒mL-1）对3个批号的样品进行试验，可对实验结果进行对比[8]。结果表明，低内毒素蔗糖稀释至质量浓度≤150 mg﹒mL-1时，不干扰细菌内毒素的检查。因此，低内毒素蔗糖用凝胶法进行细菌内毒素检查是可行的。