质谱技术在肺癌分子标志物探究中的近期应用

荆心研，卢兆莲，张 婷，胡成进，李传海

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和病死率在恶性肿瘤中位居前列［1，2］，其病死率高的主要原因是早期症状不明显，就诊时大多已处于中晚期，失去最佳的诊疗时机。在Ⅰ期肺癌中经手术治疗的患者5年生存率为54%，而未经任何治疗的患者5年生存率仅为6%［3］。因此，早诊断、早治疗是提高5年生存率、改善患者生活质量、降低病死率的关键。肿瘤标志物与低剂量计算机断层扫描、痰液细胞学等结合可提高肺癌的早期诊断率［4］。肺癌分子标志物成为肺癌研究的重点之一，而利用质谱技术对肿瘤标志物进行研究是目前的热点之一。

1 质谱技术概述

1.1 质谱仪简介质谱仪由进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成，其中质量分析器是该技术的核心［5］。目前，主要的生物质谱技术包括电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）和基质辅助激光解吸离子化质谱，前者一般与四极杆、离子阱质量分析器结合，分别组成电喷雾-四极杆质谱、电喷雾-离子阱质谱；而后者常与飞行时间质谱结合，组成基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）。MALDI-TOF-MS通常用于分析相对简单的肽混合物，而综合液相色谱ESI-MS系统（LCMS）首选用于分析复杂的样品［5］。

1.2 数据分析对实验获得的数据进行分析，是质谱分析的重要步骤之一。不同的研究需要不同的数据分析系统，如蛋白质组学的研究，可以通过数据库搜索、生物统计分析、从头测序、翻译后修饰验证等进行数据分析，各个方法都有其各自相应的应用软件［6］。

1.3 应用优势质谱分析技术具有敏感度高、特异性好、分析方式灵活等优点，能够实现在体、实时、在线、高通量的测试和分析［7］。质谱技术的飞速发展及日趋成熟使其逐渐从基础医学的研究转向辅助临床诊断。目前很多具备条件的临床实验室引进质谱仪用于临床样本的检测，例如MALDI-TOF-MS已成功进入临床微生物学实验室，成为细菌鉴定领域突破性的技术［8］。

2 质谱在肺癌分子标志物中的探究

肺癌在发生细胞形态学改变 （如异型细胞）之前，已伴随亚细胞层次的改变，而细胞和亚细胞层次改变之前发生的是分子水平的改变［7］。这些改变可导致血液、痰液、呼出气、肺泡灌洗液、组织、尿液、唾液等生物样品中相应分子水平的改变。目前许多学者利用上述各种标本结合质谱技术对肺癌特异性的分子标志物进行了相关实验研究，为肺癌的诊断提供新方法。

2.1 血浆/血清血浆/血清是辅助检查中常用的样本，在肺癌分子标志物的质谱分析研究中应用广泛。Hanas等［9］将Ⅰ期非小细胞肺癌患者、肺良性结节患者、健康体检者的血清用电喷雾质谱法在质荷比为450～1500范围内获得所有质谱峰，并创建数据集，根据留一交叉验证法分析数据，该数据集中将健康对照者与肺癌患者、肺良性结节患者鉴别的敏感性分别为89%、83%，而Ⅰ期肺癌患者与肺良性结节患者鉴别的敏感性为80%，假设生物分子及其在血清中的量反映了个体的特定生理/疾病状态，那么该实验有利于开发筛查工具用以辅助鉴别肺癌高风险患者和肺良性结节患者。安娟等［10］用铜离子螯合纳米磁珠提取非小细胞肺癌患者和健康者血清中的多肽，用MALDI-TOF-MS技术进行质谱并用统计软件分析，建立非小细胞肺癌的血清多肽分类模型，待大规模验证后该模型可用于协助肺癌早期诊断。

质谱技术在脂质代谢组学方面对肺癌分子标志物的探究也存在巨大研究前景。Ren等［11］将487名健康对照者、479例肺良性疾病患者、474例肺癌患者的血清提取脂质后，利用基质辅助激光/解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱 （MALDI-FTICR MS）进行的分析表明与肺部良性疾病相比，肺癌患者 中 的 C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：3、C20：3、C22：6升 高 ，C20：5水平下降，并建立了三个脂质组合：组合 a（C18：2、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5、C22：6）， 组 合 b （C18：0、C20：4、C20：5、C22：6）和组合 c（C16：1、C18：0、C18：1、C20：3、C22：6），比较发现，在肺部良性疾病与肺癌的鉴别中这三个组合比临床应用的肿瘤标志物（CEA和Cyfra21-1）具有更好的诊断能力。

2.2 痰液痰液中含有脱落的上皮细胞，其细胞学分析已经用于肺癌的辅助诊断［12］。Zhang 等［13］利用中性解吸提取电喷雾离子化质谱（ND-EESI-MS）技术对非小细胞肺癌患者、健康人以及肺部良性疾病患者的清晨痰标本进行实验，将获得的数据进行主成分分析，发现质谱峰 m/z 734、756、772、798、803、818为区分肺癌组与对照组的主要谱峰。其中m/z 734、756、772经碰撞诱导解离后分别被证实为［DPPC+H］+、［DPPC+Na］+、［DPPC+K］+，而 m/z 798、803分别为磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷酸酯。利用质谱技术寻找肺癌患者痰液中的特异性分子，可为肺癌的诊断提供丰富、有效的信息。

2.3 呼出气体呼出气体主要由氮气、氧气、二氧化碳、水汽和惰性气体及痕量组分组成，其中痕量组分由体内产生或从外界环境中吸收的挥发性气体组成［14］。呼气分析具有识别反映各种呼吸系统疾病发病机制炎症标记的潜力，目前质谱已经应用于呼出气中挥发性和非挥发性物质的分析［15］。呼气分析可以在气相中进行，也可以在液相——呼出气冷凝液中进行［15］。呼出气的分析主要依靠气相色谱-质谱分析法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。 Dallinga 等［16］利用 GS-MS 对正常人呼出气中的挥发性有机化合物进行实验方法的探究及分析，得到正常呼出气的组成成分，为呼出气的质谱研究奠定了基础。Filipiak等［17］将肺癌患者与健康对照者的呼出气浓缩处理后结合GC-MS分析研究，检测到癌症患者中浓度较高的挥发性有机化合物有23种，其中最重要的是正辛烷、壬烷和2，3-丁二酮；同时将呼出气、手术切除的肺癌组织、肺肿瘤细胞株分别进行对比实验，发现这三种类型的标本中检出的化合物有较高的一致性。Peralbo-Molina等［18］对肺癌患者、肺癌高风险患者及健康对照者的呼出气冷凝液进行气相色谱－飞行时间质谱 （GCTOF/MS）实验，将三组分别进行两两对照实验，发现肺癌组与高风险组比较，存在4种有差异的化合物；肺癌组与健康对照组相比较存在3种有差异的化合物；高风险组与健康对照组比较存在5种有差异的化合物。这些化合物相互结合为肺癌鉴别诊断提供依据。对呼出气的实验研究考虑呼出气中可能存在某些化合物也可以辅助诊断肺癌，但目前尚未在呼出气中发现临床意义明确的肿瘤标志物，需要进一步深入研究。

2.4 肺泡灌洗液对于胸部X线片异常的可疑肺癌患者进行光纤支气管镜检查，通过支气管清洗、支气管毛刷或支气管肺泡灌洗液进行活组织检查和（或）细胞学检测明确诊断［19］。肺泡灌洗液中含有大量脱落细胞、肿瘤凋亡细胞、坏死细胞及肿瘤分泌或释放的特异性或非特异性蛋白质分子，为肺癌的早期诊断提供了新思路［20］。 周继红等［20，21］利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术将周围型肺癌患者的血清与支气管活检肺泡灌洗液进行对比，发现肺泡灌洗液中的差异蛋白较血清中多，利用肺泡灌洗液建立分类诊断模型的诊断效率较血清高，可筛查出差异性蛋白作为诊断肺癌的肿瘤标志物。Paster等［22］将对照组、肺癌组、慢性阻塞性肺疾病（COPD）组及肺癌合并COPD患者各15例的肺泡灌洗液先进行二维凝胶电泳，找出差异蛋白，用MALDI－TOF/TOF鉴定，找到15种与氧化应激相关的蛋白，并得出转录因子NF－κB作用于氧化应激蛋白之间参与氧化应激反应通路，在肺癌的发生发展中发挥重要作用，为肺癌和COPD的诊断提供新的标志物和预测工具。Carvalho等［19］收集2014年4月—7月90例可疑肺癌患者的肺泡灌洗液用液相色谱－质谱联用仪（LC－MS）分析，经2年的随访研究，将患者2014年6月和8月分别与之前进行评估对比，发现了病例组与对照组之间存在133种差异表达蛋白，将这些差异表达蛋白与文献报道的差异表达蛋白进行比较、总结，为诊断肺癌提供有意义的实验依据。虽然肺泡灌洗液对肺癌诊断的敏感性较低（29%～69%），但其特异性高（90%～100%）的优点不容忽视［19］。

2.5 肺组织肺组织作为信息量最多的标本，在疾病的诊断中具有重要的意义。Li等［23］将肺鳞癌组织与癌旁组织分别磨成粉末后溶于匀浆缓冲溶液后提取膜蛋白，用SDS－PAGE初步分离并进行2－DE，选择差异明显的蛋白质斑点进行MALDI－TOF，发现12种蛋白在肺鳞癌患者中表达上调，9种蛋白表达下调，其中1种表达上调的蛋白和1种表达下调的蛋白经验证，结果与2－DE结果一致。也有学者利用组织喷雾技术对肺癌组织进行研究，Wei等［24］将38例肺鳞癌患者的组织及癌旁组织用LTQ－XL质谱仪对组织中的脂类分别进行质谱分析研究，发现肺鳞癌患者的组织中5个强度较高的峰，其m/z分别为：154.03、170.06、798.90、808.49、832.43，在癌旁组织中则找到强度较高的峰：m/z 203.08、757.47、782.52；并发现结合偏最小二乘线性判别分析法分析结果可以快速将癌症和非癌症肺组织区分开，准确率＞94%。

MALDI－TOF－MS激光束的空间分辨率较高，可用来研究特定生化化合物在组织上的分布，基于MALDI的质谱成像允许组织学相关的蛋白质或脂质的表达，已经成为发现生物标志物的有力工具［25］。基质辅助激光解析电离质谱用于组织成像技术（MALDI－MS imaging，MALDI－MSI） 是一种全新的分子成像技术，它不局限于特异的一种或者几种分子，可在组织切片中找到多种分子，并提供这些分子在组织中空间分布的精确信息，同时可对这些蛋白质分子进行相对定量［26］。 MALDI－MSI在肿瘤中的应用主要集中在组织蛋白质及多肽的研究，传统常用的分析组织中蛋白质的方法可以进行肿瘤标志物的定量分析，但不能评估标志物内分子空间分布情况，免疫组织化学方法保存了标本的空间信息，但前期必须知道肿瘤中的目标蛋白以进行正确的抗体染色，且一次只能测定已知的单一蛋白，而质谱方法则具有免标记、高灵敏性、高特异性、同组分同时检测的优点［27］。

2.6 尿液尿液作为人体代谢物排出机体的重要液体，任何影响体内血液成分改变的系统病变均可引起尿液成分的改变。肺癌患者体内癌细胞的代谢物可能会随尿液排出体外，尿液辅助诊断肺癌的应用价值有待开发。An等［28］利用组合式高分辨率液相色谱－质谱联用技术对肺癌患者的尿液与正常人的尿液分析，鉴定了包括氨基酸、核苷和吲哚代谢物在内的11种潜在生物标志物。随着分子物质分离方法和现代质谱鉴定技术的快速更新，尿液中蛋白质最低检出限和灵敏度大大提升，尿液肿瘤标志物的检测简便、无创、患者依从性高，使从尿液蛋白质中筛查肿瘤标志物成为研究者关注的新热点［29］。

2.7 唾液唾液收集的简单性及无创性等优点使其成为生物标志物发现过程中更具优势的标本，其中除包含口腔疾病的潜在标志物，还包含可能影响唾液腺并引起唾液量和组成变化的全身性疾病的潜在标志物［30］。 Xiao 等［31］收集肺癌患者与健康人的唾液，将10例肺癌患者和10名健康人的唾液经2DE-DIGE/MS后找到16种候选的生物标志物，筛选4种蛋白进行验证，在26例肺癌患者和26名健康者的唾液中选取3种蛋白（触珠蛋白、锌β2-糖蛋白、人钙微蛋白）确诊实验后发现3种蛋白联合分析的敏感性可达88.5%，特异性可达92.3%。研究者还用肺癌和健康人的细胞株进行验证，在肺癌细胞株中上述3种蛋白的表达均较健康人高。可见唾液在肺癌的发生发展过程中存在某些变化，可以作为研究肺癌分子标志物的标本，一旦唾液中查找肿瘤标志物成为常规检测，其简便性、无创性的优点将使之成为筛查肿瘤标志物的首选标本。

综上所述，肺癌作为我国常见的恶性肿瘤之一，其致死率占首位［32］，早诊断、早治疗是降低其病死率的关键。近年来，质谱技术发展迅速且渐趋成熟，各种技术与质谱结合寻找肺癌生物标志物的研究层出不穷。目前，质谱分析在肺癌生物标志物的研究方面应用广泛，可分析多种类型的标本，如血液、痰液、呼出气、肺泡灌洗液、肺组织、尿液、唾液等，其研究成果为改善肺癌的诊疗现状具有重要意义，质谱应用于肺癌临床诊断的时代已经来临。

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