VA菌根真菌不同接种体数量盆栽扩繁试验

韦中强++韩如刚++李娜++韩量++秦静

摘要 为了探讨药用植物黄精根际土著AM菌根真菌地球囊霉孢子在人工接种条件下，不同接种体数量对扩繁试验的影响，本文采用1%水琼脂作为活性孢子萌发培养基，以三叶草为接种宿主，在宿主种植密度为10株/dm2条件下，分别采用单孢、4孢、20孢接种处理，研究繁殖体扩繁数量的变化。结果表明，单孢接种繁殖系数最高（4 200），4孢接种中等（1 562），20孢接种最低（365）；孢子产量则以20孢接种最高，4孢接种次之，单孢接种最小。可以看出，不同接种体扩繁效应存在显著差异。该结果为土著AM真菌的纯化及扩繁培养提供了简易可行的途径。

关键词 药用植物；黄精；土著AM真菌；扩繁；繁殖系数

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）03-0080-02

菌根（mycorrhiza）是自然界中一种普遍的植物共生现象。AM真菌在植物根际形成的庞大菌丝网络系统能显著促进作物矿物质养分和水分的吸收利用[1]，促进其生长发育，改善水分状况，提高抗旱性、抗病性，增强作物对盐碱和重金属毒害的耐性，改良土壤，提高作物产量，改善品质，对实现植物根际土壤生态系统的可持续发展具有重要实践价值[2-3]。近年来，菌根技术在农业上的开发利用已取得了进展，获得了显著经济效益，越来越受到了世界各国的普遍关注。

我国VA菌根真菌资源丰富，生态适应性强，广泛存在于各种生态环境中。AM真菌是专性活体营养微生物，在无宿主存在的离体培养中，目前的技术还不能使这些真菌完成整个生活史，由此成为进一步开发和利用AM真菌的重大障碍。但是由于AM真菌具有一定的无宿主发育能力，对人类有巨大的经济效益和社会效益，促使研究人员开展了大量研究工作，希望能寻找到促进AM真菌在离体条件下可以完成其生活史的各种化学物质——AM真菌生长促进物质（stimulators），实现离体培养条件下完成AM真菌生活史的愿望，生产出高纯度、无污染、低成本的商品AM菌剂。本试验开展了AM真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）的单孢及多孢扩繁试验，现将结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

宿主植物：三叶草（Trifolium reperns）。AM菌剂：黄精根际土壤分离的VA菌根真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）。盆栽钵：市场上购买的白色塑料钵，钵高16 cm，上口内径18 cm，面积为254.34 cm2，底部内径12 cm。

1.2 试验设计

用AM真菌不同接种体（孢子）数量接种培养在特殊基质上的三叶草根系，即设3个处理，分别为单孢接种、4孢接种、20孢接种，6次重复。3个月后取培养基质提取分离新生孢子，统计分析产孢数量，确定繁殖效益。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的配制。取直径7 cm洗净的培养皿，倒入10 mL 1.0%水琼脂培养基，5皿一组叠放，用双层铝箔将其包裹，高温高压（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）灭菌15 min，晾至室温取出，移入接种箱内待用。

1.3.2 孢子表面消毒。采用湿筛倾斜法[4]分离提取的地球囊霉孢子，在光学解剖镜下挑出细胞质均匀一致的生活孢子，42 KHz超声波水浴振荡片刻去掉孢子表面的杂物，蒸馏水漂洗数次后，将孢子转入直径为3.0 cm的小玻璃培养皿中移入接种箱内，滴加几滴2%（W/V）氯铵T-200 mg/L链霉素-100 mg/L庆大霉素-吐温20液[5]，盖好上皿，进行孢子表面消毒15 min。与此同时，接种箱内盛有灭菌培养基的培养皿及所有用具也在紫外灯下表面灭菌15 min。

1.3.3 接种培养。2015年2月20日，将表面消毒后的孢子，经灭菌蒸馏水漂洗数次后，用特制的塑料小吸管分别将孢子接种在灭菌培养基表面，每皿分别接种1个、4个、20个孢子，孢子在皿中成均匀排布，用封口膜封固上下皿，20个重复。30 ℃暗箱培养10 d，绝大多数孢子萌发，待用。

1.3.4 盆栽基质的制备。取腐殖土和黄精园土，按体积比1∶1混合，pH值5.8、含磷量12.7 mg/kg、有机质含量4.12%。高温高压（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）灭菌2 h，晾至室温取出备用。

1.3.5 接种盆栽培养。2015年3月1日，孢子经表面消毒后，在1%水琼脂培养基上培养，选用萌发的单孢、4孢、20孢的地球囊霉孢子分别接种在播种有经表面消毒的三叶草种子的培养基质中，將培养10 d已经萌发的AM真菌孢子及其琼脂培养物一并倒入已装好的灭菌土的盆钵土表面以下5 cm左右，再覆土，每盆装培养土1 kg，然后在表面播入已表面消毒的三叶草种子30粒，成苗后定苗25株，宿主植物种植密度为10株/dm2。为了保温、保湿并减少被杂菌污染和病原菌侵染的机会，在盆钵上罩上透明白色的保鲜袋。在以后的培养期内，每隔10 d补充10 mL的Hoagland营养液，3个月后检测孢子数量。

1.3.6 收获、取样检测。2015年6月30日，收获三叶草培养基质，晾干后，各取10 g用湿筛倾斜法分离介质中的孢子，体视显微镜下计数。

2 结果与分析

由表1可知，在培养基质、宿主植物种类、宿主种植密度（10株/dm2）以及培养条件相同的情况下，单孢接种、4孢接种和20孢接种的孢子产量有显著差异，以20孢接种的处理孢子产量最大。因此，为获得较高的繁殖体产量，以接种较高的繁殖体数量为宜。但是，从统计结果看，4孢和20孢接种的孢子产量并不是单孢接种的孢子产量的对应倍数，相比之下，单孢接种者繁殖系数最高（4 200）、效益最好，4孢接种中等（1 562），20孢接种最低（365），接种体孢子的数量与繁殖系数成负相关（图1）。同时，单孢扩繁者的后代遗传性质较为一致，能够满足更高的科学研究和遗传育种需要。endprint

3 结论与讨论

宿主种植密度为10株/dm2且其他培养条件相同时，地球囊霉多孢繁殖可获得较多的再生孢子数量，单孢繁殖则能获得更高的繁殖系数。本文在Fracchiaa等的方法基础上略加改良，进行地球囊霉的单孢、4孢和20孢萌发接种三叶草扩繁试验，最終都获得了再生孢子，表明地球囊霉是可以进行单孢活体盆栽扩繁培养的。这为G. geospora Gerdemann的纯系培养提供了一个简易可行的途径，适于科研上需要的少量接种物的培养，或应用于经过多代的Ri T-DNA转型根[6]培养后AM真菌遗传稳定性的恢复，从而防止AM真菌侵染率的下降。目前，菌根真菌尚不能进行纯培养，菌剂培养周期长、扩繁效率低，限制了菌根在实际生产中的推广。该试验结果表明，在相同的培养条件下，单孢接种繁殖系数高。单孢培养纯度高、遗传变异小，可满足科学研究上的少量使用；多孢培养产量高，可在一定程度上满足生产使用。

4 参考文献

[1] VAN DER HEIJDEN M G A，KLIRONOMOS J N，URIC M，et al.Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity，ecosystem variability and productivity[J].Nature，1998，396：69-72.

[2] 陈敏，王和勇，廖志华，等.发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究进展[J].天然产物研究与开发，2000，12（3）：98-102.

[3] 郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001，20（1）：148-152.

[4] DANIELS B A，SKIPER H D.Methods and principles of mycorrhizal research[M].St. Paul，Minn.：American Phytopathological Society，1982：29-35.

[5] 董昌金，郑世学，郑斌，等.球囊霉属几种AM真菌孢子表面消毒与萌发的研究[J].菌物系统，2003，22（3）：410-416.

[6] 刘琴，吴震，翁忙玲，等.发根农杆菌Ri质粒及其在植物科学中的应用[J].生物技术通报，2002（5）：21-25.endprint