Bmi-1基因沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学行为的影响

王巧，罗清，李亚军，3，邹彦

(1贵州省人民医院，贵阳550002；2遵义医学院附属肿瘤医院；3遵义医学院第三附属医院)

鼻咽癌(NPC)是我国常见的恶性肿瘤，好发于鼻咽部咽隐窝和顶前壁，在我国南部及东南亚具有较高的发病率[1,2]。放疗和化疗是NPC主要的治疗手段，然而，仍有约20%的患者在治疗后出现局部复发和远处转移，导致Ⅲ～Ⅳ期NPC患者的5年生存率仅为10%～40%[3]。因此，寻求更高效、安全的治疗方法是临床关注的重点。Bmi-1是多梳基因家族(PcG)的重要成员，在乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种实体瘤组织中高表达[4～6]，参与肿瘤发生、发展的多个生物学行为，如细胞增殖、侵袭及凋亡、肿瘤发生及干细胞的自我更新和分化[7]。研究发现，Bmi-1在癌组织中的表达水平与肿瘤形成、疾病进展、侵袭与转移及疾病不良预后密切相关[8,9]。2014年10月～2016年3月，本研究用shRNA慢病毒特异性沉默NPC的CNE2细胞内Bmi-1基因表达，探讨其对细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，为NPC的分子靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人胚肾上皮细胞(293T)购买于昆明细胞库，人NPC细胞株(CNE2)由广州中山医科大学培养，慢病毒载体PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG购于长沙赢润生物技术公司，LipofectamineTM2000购于上海英潍捷基贸易有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购于TaKaRa，兔抗人Bmi-1多克隆抗体购于英国Abcam公司，二抗-山羊抗兔、内参β-actin购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 PLVx-shRNA2-Bmi-1重组载体的构建 查找Bmi-1(NM=005180)在GeneBank中的mRNA核苷酸链，根据shRNA设计原则，设计3条不同的shRNA干扰片段，分别设计酶切位点：EcoRI、BamHI，引物合成由上海生工生物公司完成。shRNA1的F序列：ATCCGGAATGGTCCACTTCCATTGATCAAGAGT-

CAATGGAAGTGGACCATTCCTTTTTTG；shRNA2的F序列：GATCCGGGTCATCAGCAACTTCTTCTTCAAG-

AGAGAAGAAGTTGCTGATGGACCCTTT；shRNA3的F序列：GATCCGCCAATGGCTCTAATGAAGATTTCA-AGAGAATTTCATTAGAGCCATTGGCTTTTTTG。

1.3 慢病毒包装、浓缩及滴定 将PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG按照TIANGEN(DP106)进行质粒提取，轻柔加入LipofectamineTM2000与各质粒DNA混合液，共转染处于对数生长期293T细胞，常规培养过夜，上述培养条件孵育48 h收集细胞上清液，于4 ℃、3 000 g、离心20 min，加入Lenti-XTM concentrator获得病毒浓缩液。采用孔稀释法测定病毒滴度，将病毒原液按10倍梯度稀释。取10个无菌的EP管，每个管中加入无血清培养基90 μL，取待测的病毒原液10 μL 加入第1个管，混匀，取 10 μL加入第2个管，继续相同操作至最后一管。各管分别取10 μL 加入各孔293T细胞，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，计算病毒滴度，病毒滴度(TU/mL)=表达荧光细胞数/病毒原液量。

1.4 CNE2细胞感染及最佳沉默效率筛选 采用含10%胎牛血清的培养基培养CNE2细胞，常规换液传代。取出病毒液，浓度进行梯度稀释，使其感染复数(MOI)分别为100、10、1。加入Polybrene储液1 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育30 min。感染48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，当GFP大于80%用于后续实验，此时MOI为最佳。选取MOI=100用于后续实验感染CNE2细胞。将CNE2细胞随机分为5组，对照组不进行感染，shRNA1、2、3组分别感染表达shRNA1、2、3的慢病毒，空载体组感染空载的慢病毒。感染48 h后用TRIzol法提取细胞总RNA，根据试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR反应，读取Ct值，应用2-ΔΔCt法计算Bmi-1基因的相对表达量。提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，根据说明书用TBST液稀释一抗(Bmi-1 1∶1 000，β-actin 1∶3 000)，4 ℃孵育过夜，次日TBST液洗膜3次，每次5 min；同样方法稀释二抗(1∶4 000)，室温孵育2 h后进行ECL显色，凝胶图像分析系统成像，Image J软件测出目的条带的灰度值，计算Bmi-1蛋白相对表达量。根据RT-PCR及Western blotting法检测结果，筛选沉默Bmi-1的最佳干扰序列。

1.5 Bmi-1基因沉默后CNE2细胞增殖能力检测 采用平板克隆形成实验。感染48 h后收集各组细胞，接种于6孔板，400个/孔，37 ℃、5% CO2环境中培养，根据细胞生长情况换液，培养2周或肉眼可见克隆斑时，4%甲醛固定细胞15 min；PBS清洗3次，结晶紫染色20 min，PBS洗净后晾干，拍照，计数细胞。

1.6 Bmi-1基因沉默后CNE2细胞凋亡和周期检测 采用流式细胞术。感染48 h后收集各组细胞，常规培养，胰酶消化，用培养基重悬细胞。加入1×BindingBuffer 400 L轻柔重悬细胞沉淀。移取AV-FITC(暗室操作)5 μL，混匀后室温暗室孵育15 min。移取PI 10 μL，混匀后暗室中放在冰上5 min，30 min内上机检测细胞凋亡比例。细胞周期样品制备(同细胞凋亡)，用冷却的70%乙醇1 000 μL混匀细胞，沉淀，置于4 ℃冰箱2 h以上，1 000 g离心5 min，换PBS重复上述步骤。加入PI 500 μL，轻柔吹打细胞，置37 ℃暗室，检测各期细胞比例。

2 结果

2.1 PLVx-shRNA2-Bmi-1重组质粒测序鉴定结果 将构建的PLVx-shRNA2-Bmi-1进行序列分析，结果显示：插入的序列与设计的3条shRNA序列碱基排列一致，说明目的片段均已正确插入，PLVx-shRNA2-Bmi-1慢病毒表达载体构建成功。

2.2 Bmi-1-shRNA的沉默效率 对照组、空载体组及Bmi-1-shRNA1、2、3组中Bmi-1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.98±0.01、0.45±0.03、0.17±0.01、0.14±0.01。与其他两组比较，Bmi-1-shRNA1、2、3组Bmi-1 mRNA相对表达量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3组最低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3的抑制效率=(1-0.14)/1×100%=86.00%。对照组、空载体组及Bmi-1-shRNA1、2、3组中Bmi-1蛋白相对表达量分别为0.89±0.02、0.86±0.04、0.67±0.01、0.54±0.05、0.36±0.04，与其他两组比较，Bmi-1-shRNA1、2、3组Bmi-1蛋白相对表达量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3组最低(P均<0.05)。

2.3 沉默Bmi-1基因对CNE2细胞增殖的影响 空载体组、Bmi-1-shRNA3组中细胞克隆形成数目，分别为(271.67±18.77)、(203.3±20.21)个/视野，与空载体组比较，Bmi-1-shRNA3组增殖能力弱(P均<0.05)。

2.4 沉默Bmi-1基因对CNE2细胞凋亡的影响 空载体组、Bmi-1-shRNA3组中细胞凋亡率分别为10.00%±0.40%、 12.97%±0.72%，与空载体组比较，Bmi-1-shRNA3组细胞凋亡率高(P均<0.05)。

2.5 沉默Bmi-1基因对CNE2细胞周期的影响 空载体组、Bmi-1-shRNA3组中G1期细胞比例分别为45.57%±10.34%、67.98%±7.85%，S期细胞比例分别为38.62%±6.12%、24.74%±5.58%，与空载体组比较，Bmi-1-shRNA3组G1期细胞比例高，S期细胞比例低(P均<0.05)。

3 讨论

放疗和化疗是NPC主要的治疗手段，然而，由于NPC解剖部位的特殊性及早期临床症状不明显，导致大部分患者在就诊时已是局部晚期或远处转移，致使NPC 5年生存率低，临床预后差[10]。Bmi-1基因最早在鼠淋巴瘤细胞中发现[11]，是PcG家庭的重要成员。PcG家族是由多种与细胞周期和增殖相关的转录抑制因子组成，是一类重要的与发育相关的基因，在干细胞的维持、胚胎发育和肿瘤发生中有着不可忽视的作用。研究发现，Bmi-1基因在癌组织中的表达高低与肿瘤形成、疾病进展、侵袭与转移、疾病不良预后密切相关[8,9]。

目前，有关Bmi-1基因在NPC中的研究国内外报道甚少。为了研究沉默Bmi-1基因对NPC细胞生物学行为的影响，为NPC的分子靶向治疗提供实验依据，本研究采用RNAi感染技术，构建慢病毒表达载体特异性沉默Bmi-1基因。该技术可特异性剔除或关闭特定基因的表达，抑制靶点基因。与腺病毒系统、逆转录表达系统相比，慢病毒载体系统具有持久、稳定地表达外源基因的优点。因此，本研究选取了慢病毒“四质粒”系统进行病毒包装，即慢病毒表达载体(PLVx-shRNA2)、包装载体(PLP1、PLP2、PLP/VSVG)、脂质体2000共转染293T细胞。镜下观察到293T持续表达荧光，与Xu等[12]的研究结果一致，说明PLVx-shRNA2-Bmi-1重组载体已成功感染293T细胞。

Liu等[13]研究发现，RNAi干扰技术可抑制Bmi-1基因在乳腺癌MCF-7细胞的表达，其抑制率可达80%。本研究为获得沉默Bmi-1基因最佳的干扰片段，设计并合成了3条针对Bmi-1基因的shRNA1、2、3片段，检测结果显示，shRNA1、2、3对Bmi-1均有不同程度的抑制，其中shRNA3的抑制效果最佳，抑制效率约为86%。由于慢病毒载体感染对宿主细胞有一定程度的细胞毒性，在感染前需摸索慢病毒的最佳MOI值，本研究结果显示，当MOI=100时，CNE2细胞的感染效率为80%以上。

研究指出，作为INK4a/ARF基因的转录抑制位点，Bmi-1主要通过编码p16INK4a和p14ARF(动物为p19ARF)两个肿瘤抑制蛋白进行调控。P16INK4a能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，通过CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F使细胞停滞于G0/G1期，无法进入S期。P14ARF则通过MDM2-P53通路来调控细胞周期，进而达到调控细胞周期、细胞凋亡以及维持肿瘤干细胞自我更新能力的目的[14，15]。降低Bmi-1基因在宫颈癌细胞中的表达会导致G1期细胞比例增加。本研究结果证实，沉默Bmi-1基因后，转染组细胞凋亡率升高，G1期细胞比例增加。Zhou等[16]研究指出，沉默Bmi-1基因能抑制ECA109细胞的增殖能力。本研究结果显示，沉默Bmi-1基因后，转染组克隆形成数减少，增殖能力受到抑制。

综上所述，本研究成功完成了慢病毒重组载体PLVx-shRNA2-Bmi-1的构建，筛选并获得了沉默Bmi-1效果最佳的干扰片段(Bmi-1-shRNA3)，证实了Bmi-1基因表达降低可抑制CNE2细胞增殖，促进其凋亡，改变细胞周期。这可能为NPC的分子靶向治疗提供实验依据。

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