间尼索地平对人孕烷X受体介导的CYP450酶的转录调节作用

刘艳艳，万昶宸，孙宇鹏，张 霞，廖 曼，程晓叶，张兰桐

(河北医科大学药学院药物分析教研室，河北 石家庄 050017)

间尼索地平(m-nisoldipine，MNS)[化学名称：1, 4-二氢-2, 6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯异丁酯]是由河北医科大学药学院首次合成的一类新型二氢吡啶类药物，存在一个手性中心，可拆分为两个光学对映体(R,S-m-nisoldipine)[1]。二氢吡啶类药物为钙通道拮抗剂，特异性高，在临床上广泛用于治疗高血压。

细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是一组结构和功能相关的同工酶，参与代谢90%以上的药物[2]。CYP450酶容易被多种物质激活，其活性的高低是影响许多药物疗效及药物间相互作用的原因之一。人孕烷X受体(human pregnane X receptor，hPXR)[3]为研究较为深入的一类核受体，是能够调控药物代谢酶和转运体基因表达的转录调控因子，在物质代谢中起重要作用。许多药物能够作为hPXR配基而激活该受体，继而识别和结合到靶基因启动子特异的DNA序列上，上调CYP酶家族主要亚型的表达[4]。CYP450酶的表达可以被诸多外源性物质所诱导，以往研究已证明这种诱导主要是经核受体hPXR介导的。胡东莉[5]研究了硝苯地平通过hPXR受体对CYP450酶的调节机制。本文基于酶诱导的分子机制，通过构建包含CYP450启动子调控元件的荧光素酶报告基因载体，建立了药物诱导剂的体外筛选体系，研究间尼索地平诱导作用的分子机制，可用于预测间尼索地平对映体是否具有潜在的代谢酶诱导作用，进而指导药物开发及其临床应用。

1 材料与方法

1.1药物与试剂R,S-MNS原料药为本院药物化学教研室提供，含量>99.5%；限制性内切酶NcoI、XhoI、BglII、KpnI和连接酶EL0011购自Thermo Fermentas；Lipofectamine 2000脂质体试剂购自Life Technology；KOD-FX DNA聚合酶购于Toyobo；DMEM培养基、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清均购自Gibco公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；无内毒素质粒提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒均购自Omega。

1.2仪器洁净工作台(苏净安泰)；荧光倒置显微镜(Olympus)；二氧化碳培养箱(Sanyo)；JY04S-3C凝胶成像系统、JY300C电泳仪、JY-SPFT电泳槽(君意东方)；PCR扩增仪(Bioer)；酶标仪(BioTek Gene5)。

1.3启动子及hPXR基因序列的获得根据NCBI核酸数据库中序列号信息(GenBank ID: 1555、1559、1576、8856)设计启动子及hPXR相应PCR特异性引物。引物序列见Tab 1，其中CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4引物序列上游引物存在KpnI位点，下游引物存在BglIII位点，hPXR序列上游引物存在NcoI位点，下游引物存在XhoI位点。以人肝DNA为模版，分别扩增相应启动子调控序列和基因片段。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，在紫外灯下切取含有目的条带的胶条，使用凝胶回收试剂盒纯化回收目的DNA片段，保存于-20℃备用。

Tab 1 Primer sequences of cytochrome P450s and hPXR

1.4载体的构建双荧光素酶表达载体和包含CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4启动子的双荧光素酶报告载体的构建参照文献[6]。参照pGL3-basic多克隆位点以及基因区域酶切位点，在基因5’引入KpnI，在3′引入BglIII，将改造后的pGL3-basic载体分别与PCR扩增的CYP450酶片段以KpnI和BglIII限制性内切酶进行双酶切，T4 DNA连接酶进行连接反应。参照pcDNA多克隆位点以及基因区域酶切位点，在基因5’引入NcoI，在3′引入XhoI，将改造后的pcDNA表达载体与PCR扩增的hPXR片段以NcoI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，T4 DNA连接酶进行连接反应。将连接产物直接转化，挑取单克隆进行PCR鉴定，PCR鉴定表达载体和报告载体质粒中是否含有所需目的片段。将鉴定正确的克隆菌液送至金唯智生物科技有限公司测序[7]。构建的载体测序检测正确后命名为P1：pGL3-CYP2B6-promoter；P2：pGL3-CYP2C9-promoter；P3：pGL3-CYP3A4-promoter；PXR：pcDNA3.1-hPXR+GFP。

1.5细胞培养与转染HepG2细胞用DMEM+10% FBS进行培养。转染前取对数期生长的细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞。转染时，将100 ng pGL3-CYP2B6-promoter或pGL3-CYP2C9-promoter或pGL3-CYP3A4-promoter，100 ng pcDNA3.1-hPXR+GFP或 pcDNA3.1+GFP空载体，10 ng作为内对照的pRL-TK，0.3 μL LipofectamineTM2000阳离子脂质体，与50 μL转染用Opti培养基混合孵育，放置5-10 min，当DNA-脂质体复合物形成后，以每孔100 μL的量将DNA-lipo2000-opti复合物加入96孔板，转染6～8 h后，弃去原培养基，换正常培养基培养，过夜后进行药物处理。

1.6待测药物处理和荧光素酶活性检测R,S-间尼索地平分别用DMSO配制, 细胞转染8 h后，分别加入9.7、2.425、1.2125 mg·L-1的R-间尼索地平和S-间尼索地平药物培养48 h，同时设置仅含0.1% DMSO的对照组。处理后的细胞用双荧光素酶活性分析试剂盒处理，分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性值，设置3个复孔。

2 结果

2.1不同浓度R,S-间尼索地平对hPXR介导的CYP450酶的诱导作用R-间尼索地平在1.2125 mg·L-1浓度下不能通过hPXR产生诱导作用，但在2.425、9.7 mg·L-1浓度下诱导CYP2B6表达增加2.11和2.44倍，在9.7 mg·L-1浓度下诱导CYP2C9表达增加2.78倍，在2.425、9.7 mg·L-1浓度下诱导CYP3A4表达增加2.56和2.89倍，与0.1% DMSO溶媒对照组差异有显著性(P<0.05)。

S-间尼索地平在2.425、9.7 mg·L-1浓度下诱导CYP2B6表达增加1.56和2.67倍，在1.2125、2.425 mg·L-1浓度下诱导CYP2C9表达增加1.55和1.96倍，与0.1% DMSO溶媒对照组差异有显著性(P<0.05)，但不能通过PXR对CYP3A4产生诱导作用。

3 讨论

人体内CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4与大部分现有临床药物的代谢相关。间尼索地平为二氢吡啶类药物，有研究发现[8]，长期给与大鼠R,S-间尼索地平后，对CYP2B、2C、3A亚型有诱导作用。为研究该药物对人体内各酶亚型的影响，本文利用荧光素酶系统证实这种调节是由hPXR来介导的。

在本实验中，R,S构型药物对CYP2B6的诱导作用可以通过hPXR介导，并表现出明确的剂量-效应关系。R构型药物在高浓度下明显诱导CYP2C9表达，而S构型在低、中浓度下可以明显诱导CYP2C9表达，造成这种现象的原因可能是由于R和S构型药物对hPXR活化程度不同，从而影响后续与CYP2C9启动子结合。R构型药物对CYP3A4的诱导作用可以通过hPXR介导，并表现出明确的剂量-效应关系，但S构型药物对CYP3A4无明显诱导作用，这可能是两个构型的药物结构上的不同影响hPXR通路诱导CYP3A4表达。

本研究成功建立了CYP450酶的药物诱导剂的体外筛选体系，为间尼索地平临床应用提供基础，但间尼索地平的不同构型是否与其他代谢酶底物存在着潜在的竞争性抑制，从而造成基于代谢酶的药物相互作用而限制其临床应用，需要进行更深入的研究，并成为临床用药必须考虑的问题。

[1] Sun Y P, Jia P P, Yuan L, et al. Investigating the in vitro stereoselective metabolism of m-nisoldipine enantiomers: characterization of metabolites and cytochrome 450 isoforms involved[J].BiomedChromatogr, 2015,12(29): 1893-900.

[2] Zanger U M, Schwab M. Cychrome P450 enzymes in drug metabolism: Regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation[J].PharmacolTher, 2013,138: 103-41.

[3] Niemira M, Dastych J, Mazerska Z. Pregnane X receptor dependent up-regulation of CYP2C9 and CYP3A4 in tumor cells by antitumor anridine agents, C-1748 and C-1305, selectively diminished under hypoxia[J].BiochemPharmacol, 2013,86:231-41.

[4] Lemaire G, Sousa G D, Rahmani R. A PXR reporter gene assay in a stable cell culture system: CYP3A4 and CYP2B6 induction by pesticides[J].BiochemPharmacol, 2004,68: 2347-58.

[5] 胡东莉. 硝苯地平对人孕烷X受体介导的CYP2B6和CYP2C9的转录调节作用的研究[D]. 长沙：中南大学, 2013.

[5] Hu D L. The transcriptional regulation effects of nifedipine on CYP2B6 and CYP2C9 activities inducible mediated by hPXR[D]. Changsha: Central South University, 2013.

[6] Chen Y P, Ferguson S S, Negishi M, et al. Induction of human CYP2C9 by rifampicin, hyperforin, and phenobarbital is mediated by the pregnane X receptor[J].JPharmacolExpTher, 2004,308: 495-501.

[7] 韦忠红, 朱智杰, 刘玉萍, 等. TNF-α 3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选[J]. 中国药理学通报, 2015,31(1): 77-81.

[7] Wei Z H, Zhu Z J, Liu Y P, et al. Construction of pGL3-TNF-α 3′-UTR luciferase reporter gene and tanshinone compounds screening[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(1): 77-81.

[8] 孙宇鹏. 基于细胞色素P450代谢酶的间尼索地平代谢转化及药物-药物相互作用 (DDI) 研究[D]. 石家庄：河北医科大学, 2016.

[8] Sun Y P. Drug-drug interaction and metabolism of m-nisoldipine based on cytochrome P450[D]. Shijiazhuang: Hebei Medical University, 2016.