高邮鸭主要免疫器官的表型发育及其与TLRs表达的相关性分析

朱春红，刘宏祥，陶志云，徐文娟，宋卫涛，章双杰，李慧芳

(江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125)

机体免疫器官的发育状况直接反映出机体的免疫应答水平，家禽免疫器官(法氏囊、脾脏、胸腺等)的重量发育是评价家禽免疫力影响的重要指标[1]。脾脏作为重要的淋巴器官，也是机体最大的外周免疫器官，是产生致敏淋巴细胞和抗体的场所之一，同时具有造血、滤血、清除衰老细胞和微生物等功能。法氏囊是禽类特有的免疫器官，在70～80日龄时体积最大，以后逐渐消退，性成熟时消失。鸭胸腺有6～7叶，分布于颈静脉，多叶排列，成年后萎缩退化。家禽免疫器官发育不良，或者其他原因导致免疫抑制，家禽免疫抑制会增强机体对病毒、细菌以及寄生虫的易感性，对各种接种疫苗的反应能力下降，造成养殖业的巨大损失[2-3]。

TLRs是一类胚系编码的模式识别受体，通过识别病原微生物特有的分子，从而识别入侵的微生物，在机体固有免疫中发挥重要作用[4-7]。目前，在小鼠中发现的TLRs有12种，人类有10种[8]。家禽TLRs研究进展落后，禽类TLRs的研究基本集中于鸡上，鸭种中的研究仅近几年有增长趋势。禽类中，在鸡中发现的有10种，分别为TLR1La、TLR1Lb、TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21[9-10]，在鸭中发现的为9种，包括TLR1A、TLR1B、TLR2A、TLR2B[11]、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15[12]，未发现TLR21。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5主要识别细菌[13]，TLR3和TLR7主要识别病毒，TLR15和TLR21既可识别病毒又可识别细菌[14]。Muzio等[15]对TLRs在人类白细胞中表达的研究发现，TLR1能在包括单核细胞、多形核细胞、T、B淋巴细胞及NK细胞等多种细胞中表达，TLR2、TLR4、TLR5只在髓源性细胞(如单核巨噬细胞)上表达，而TLR3只特异性表达于树突状细胞(Dendritic cells，DC)。在对抗外来物质入侵的过程中，天然免疫发挥的作用显得尤为重要，被看作是机体的第一道防线，TLRs是其中重要一员；不同的TLRs，在不同组织部位的表达，可能发挥不同的功能，但其在发育进程中，在水禽中枢器官和外周免疫器官中的表达分析目前仍无研究报道，本研究对高邮鸭免疫器官发育进行测量，分析TLRsmRNA在高邮鸭免疫器官发育进程中的表达模式，可以为TLRs在鸭先天免疫和抗感染中的作用研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

2×PCR mix、PCR产物回收试剂盒、DNA纯化试剂盒、TRNzol-A+总RNA提取试剂、Quant cDNA 第一链合成试剂盒、SYBR Green SuperRealPreMix试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司，DNA Marker DL2000购自TaKaRa生物有限公司,琼脂糖和DEPC购自Promega生物有限公司。

组织匀浆机为瑞士Kinematica PT1200E，高速冷冻离心机为Eppendorf 5417R,生物分光光度计为Eppendorf AG 22331Hamburg,PCR仪为Eppendorf mastercycler，紫外分光光度计为Pharmacia GeneQuant Ⅱ，凝胶成像系统为Tanon 3500R产品，荧光定量分析采用Stratagene公司的Mx3000P型PCR仪。

1.2 试验动物

120只雏鸭(购自江苏高邮鸭集团)国家标准正常饲养至1，2，4，6，8周龄，在不同周龄随机选取24个个体(公母各半)，个体称重后解剖，采集免疫器官：脾脏、胸腺、法氏囊，剔除脂肪准确称量，记录绝对质量(湿重量)后，立即放入-80 ℃保存待用。

1.3 引物设计

参考GenBank收录的鸭TLRsmRNA基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，引物序列见表1。

表1 PCR用引物Tab.1 Primers used for the PCR

1.4 RNA的提取，反转录

将采集的组织样品分别称取30 mg左右，置于含1 mL TRNzol的2 mL离心管中，用小剪刀剪碎，组织匀浆机匀浆，按照TRNzol-A+试剂说明书提取总RNA，总RNA置于-80 ℃保存备用。根据FastKing RT kit(with gDNase)(KR116) 第一链cDNA合成试剂盒说明书进行反转录，反转录分两步进行，第一步先去除gDNA，反应体系为：5×gDNA Buffer 2 μL，总RNA 1 μg，加水补足到10 μL，混匀后简短离心，置于42 ℃，孵育3 min，置于冰上放置。第二步即反转录，反应体系为：10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，Rnase-Free ddH2O 补足至10 μL，然后将此混合液加入到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min后放于冰上，-20 ℃保存备用。

1.5 基因TLRs及β-actin mRNA扩增及测序

PCR反应体系总体积为25 μL，其中2×PCR mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA产物1 μL, ddH2O 补足至25 μL。PCR反应程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后的产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测为单一条带并在相应的片段区间内PCR产物进行凝胶回收和纯化后送上海生工生物科技有限公司测序。测序结果用在线BlastN软件与相应的基因序列进行比对。

1.6 高邮鸭TLRs mRNA及β-actin荧光定量PCR扩增

将采集的样品进行RNA提取和反转录后获得cDNA，每个样品吸取1 μL制成mix样品，然后将mix样品进行2倍梯度稀释制成标准样品，以此为模板荧光定量PCR扩增相应的鸭TLRs和β-actin基因，获得标准曲线。反应体系为：SYBR Premix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,50×ROX 0.4 μL，cDNA模板2 μL,ddH2O补足至20 μL。实时荧光定量PCR反应程序：95 ℃变性5 min；95 ℃变性25 s，60 ℃复性25 s，72 ℃延伸25 s，40个循环；95 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，95 ℃延伸30 s，收集溶解曲线。

1.7 数据分析

荧光定量试验结果采用相对比较2-ΔΔCt法分析，首先计算出各样品目的基因与内参基因的Ct差值(ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)，分别选取表达量最低的组织为对照，以其他组织Ct差值减去对照Ct差值，即为ΔΔCt，即ΔΔCt=(ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)试验组-(ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)对照组。数据采用SPSS 20.0软件进行独立样本t检验，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 高邮鸭体重和免疫器官的发育及其相关性分析

高邮鸭体重发育和品种志中该品种性能观测记录值相当，不同周龄间的体重变化表现出显著差异，说明本试验群体在试验周期内表现为正常饲养状态。胸腺发育在前4周育雏期内，有缓慢增重表现，但未表现出显著差异，随后发育明显，6周龄，8周龄时展示出显著的增重变化(P<0.05)；脾脏发育在1周龄和2周龄时表现出显著差异(P<0.05)，本次测定结果发现脾脏在2周龄和4周龄之间增重缓慢，6周龄和8周龄之间增重也未有显著性差异。脾脏增重和法氏囊的增重结果在8周龄内表现一致，详细结果见表2。

表2 高邮鸭8周龄内体重和免疫器官发育变化Tab.2 Development changes of body weight and immune tissues in Gaoyou duck g

注：不同小写字母表示显著水平差异(P<0.05)。表4同。

Note： Different lowercases indicate significant difference inP<0.05 level. The same as Tab.4.

体重和各免疫脏器重相关性结果发现，体重和免疫器官重相关性较高，和脾脏、胸腺的相关系数为0.92，和法氏囊的相关性最小，为0.76；免疫器官发育之间的相关性较小，脾脏与法氏囊和胸腺发育的相关指数分别为0.71，0.89，法氏囊和胸腺重发育的相关指数最小，为0.64。详细结果见表3。

2.2 鸭TLRs基因片段的PCR扩增，实时荧光定量PCR产物特异性，标准曲线绘制

对所提取的组织总RNA进行反转录和PCR扩增，分别得到与预期大小相符的单一扩增条带，将所扩增的鸭TLRs基因片段纯化后测序，BlastN比对相应的目的基因，证实为对应的TLR1/2/4/5基因。

表3 高邮鸭体重和免疫器官重的发育相关系分析Tab.3 Correlation of body weight and immune tissue weights in Gaoyou duck

经溶解曲线分析，高邮鸭TLR1/2/4/5和内参基因β-actin的溶解曲线均呈单峰，无引物二聚体或其他杂峰。TLR1/2/4/5和β-actin的溶解温度分别为81.0，88.0，85.0，82.5，87.5 ℃。

以梯度稀释后的样品为模板进行鸭TLR1/2/4/5和内参基因β-actin荧光定量PCR，获得相应的标准曲线见图1，各基因的扩增效率(Eff)分别为104.6%，102.8%，101.4%，105.0%和104.6%，相关系数(Rsq)分别为0.992，0.987，1.000，1.000和0.994。

A. TLR1; B.TLR2; C. TLR4; D. TLR5; E.β-actin。

2.3 高邮鸭TLRs基因在不同发育时期免疫组织中的相对表达量

在本研究测定的范围内，胸腺中TLR1/2/4/5在1周龄时的表达量较高，TLR1/4在1周龄时的表达量显著高于其他周龄(P<0.05)；TLR1/2/4在2，4，6，8周龄时表达差异不显著；TLR5在2周龄时表达量最低，显著低于1周龄和8周龄(P<0.05)。脾脏组织中各基因的表达变化如表4所示，TLR1/2/5在8周龄时的表达量显著高于其他周龄(P<0.05)，2周龄时表达量最低；TLR4在1，2周龄时表达量较高，1周龄时表达量显著高于4，6，8周龄表达量(P<0.05)。法氏囊中各基因表达结果显示TLR1/5在8周龄时表达水平相对较高，TLR4在1周龄时，表达水平较高，显著高于其在4，6，8周龄时的表达水平(P<0.05)。

表4 高邮鸭不同发育时期TLRs在免疫组织中的相对表达量Tab.4 The relative expression level of TLRs during different development periods in Gaoyou duck

2.4 体重和免疫器官重与基因表达水平相关性分析

免疫器官重量发育和对应器官中TLR1/2/4/5基因的表达量相关系数较低，除法氏囊中TLR1表达量与体重、法氏囊重相关系数分别为0.78，0.56；脾脏TLR1的表达量与体重、脾脏重变化的相关系数分别为0.75，0.73，TLR5的表达量与体重的相关系数为0.53；其他对应的相关系数值均小于0.50。具体结果如表5所示。

不同免疫器官内TLR1/2/4/5基因表达水平的相关性分析结果发现(表6)，不同免疫组织中TLR1/2/5基因表达量之间表现为正相关。法氏囊中各基因的表达量两两之间的相关系数较小；在脾脏组织中，TLR1的表达量和TLR2以及TLR5表达量相关系数值较高，分别为：0.74，0.73，TLR2和TLR5表达量之间的相关系数为0.58；在胸腺组织中，不同TLRs基因表达量的两两相关系数值相对较高，不同TLRs基因两两之间的相关系数值均大于0.50，最高值为0.89。

表5 高邮鸭体重和免疫器官重与TLR1/2/4/5相关性分析Tab.5 The correlation analysis of expression level TLR1/2/4/5 and body weight, immune tissue weights in Gaoyou duck

表6 高邮鸭不同免疫器官内各基因表达水平的相关性分析Tab.6 The correlation analysis of expression levels in different TLRs in Gaoyou duck

3 讨论

本试验过程中，饲养群体体重发育和品种志中记录数据一致，说明本饲养群体状态良好，可以进行发育性各项指标测定。胸腺和法氏囊均表现为性成熟后重量开始下降，体积逐渐缩小，到成年时仅剩下痕迹，或完全消失。胸腺、法氏囊退化发生的时间与物种、性别及饲养方式等有关。法氏囊作为中枢免疫器官，不仅是B细胞及抗体生成的主要场所，也是大量影响其发育、功能形成及与免疫功能发育关键基因的聚集地，在机体免疫系统中扮演着重要角色。本研究中免疫器官发育状态的数据测定和相关性分析检测，为高邮鸭生长发育状态提供基础数据。

反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法具有特异性强、敏感性高、自动化程度高等特点，目前广泛用于基因表达的研究。本试验采用该方法进行TLR1/2/4/5基因在高邮鸭发育过程中免疫器官的表达水平分析[12]。包括β-actin在内的5个基因其扩增产物溶解温度均呈现单一特异性单峰，说明本试验中设计的引物特异性较强，可以用于定量测定。Comparative Delta-delta Ct法相对定量结果分析要求，目的基因和看家基因的扩增效率相似，越接近100%越好[16]，水禽课题组利用上述方法建立多个鸭相关基因表达模式的检测[17-18]。TLR1/2/4/5基因与β-actin的扩增效率在101.4%～105.0%，均接近100%，且TLR1/2/4/5基因与β-actin的荧光定量PCR反应相关系数在0.987～1.000，说明本试验中建立的荧光定量PCR方法稳定可靠。因此，可以用此方法进行4种基因的相对定量结果分析。

关于TLRs基因在组织中的表达已有较多研究报道，例如，鸡上的研究结果表明，雏鸡TLR1、TLR2、TLR4、TLR5在脾脏、法氏囊、胸腺和各段肠道组织中均有转录，但不同脏器组织中的表达水平不一[13]。采用荧光定量PCR法对牦牛TLR2和TLR4在不同组织中的研究表明，TLR2和TLR4在所有组织中均有表达，TLR2在小肠中表达量最高，而TLR4在乳腺中表达量最高[19]。在蒙古马中的研究表明，TLR1、TLR2、TLR4、和TLR6 4种TLRs在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、空肠、盲肠和骨髓中均有转录[20]。上述研究表明，在不同物种中各TLRs在不同组织中表达水平不一。但在物种发育进程中的表达水平变化报道则相对较少。本研究结果表明，鸭TLR1、TLR2、TLR4、TLR5在发育中的免疫脏器中均有表达，表达模式不同。

脾脏和法氏囊中TLR1表达在8周龄时表达量最高，在前4周内表达量则相对较低，但在胸腺中则是在1周龄时表达量最高，其他周龄点表达水平则差异不显著。TLR2在法氏囊中表达水平较胸腺和脾脏中表达水平稍低，且在不同周龄中表达水平差异不显著。 在胸腺和脾脏中分别是在1周龄和8周龄时表达量显著高于其他周龄，总的来说在不同组织中的表达水平不一。而TLR4均表现为在1周龄时表达水平较高。TLR5在不同脏器中则表现为不同表达趋势，胸腺中1周龄时表达量最高，而在脾脏和法氏囊中则是8周龄时表达量最高。上述这些非规律性表达变化对宿主免疫水平的影响如何，是后期研究的重点。

相关性分析结果表明，上述基因的表达和体重以及免疫器官重的相关性不大，比较而言，脾脏中各基因的表达水平相关性系数稍高，最高为TLR2和TLR4表达水平相关系数为0.89。上述结果是否意味着脾脏中这些基因的网路功能更强。脾脏作为重要免疫器官，TLRs是在高邮鸭或者其他鸭品种中作为天然免疫的重要组成部分，在抗感染过程中起着重要作用。

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