浅论荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒比较研究

蒋邱逃 孙华杰

（1四川省成都市武侯区疾病预防控制中心 四川 成都 610041）（2深圳市龙华区疾病预防控制中心 广东 深圳 518000）

1.前言

传统PCR需要分离染色，定量不准，因此在退火、延伸过程中对核酸中EB含量进行检测，从而对目标基因精确定量。此方法为非特异性的，仅能反映核酸总量。于是在接下来的几年中，研发出了实时荧光定量PCR技术，比原技术有了质的飞跃，使得DNA定量更高效，分析更准确，灵敏性更高。

因此对诺如病毒进行相应的检测尤为必要，主要检测方式有逆转录-聚合酶链反应(即RT-PCR)以及酶联免疫吸附实验(即ELISA)。又因为该病毒不能体外培养，相关动物模型匮乏，变异型较多，为检测增加了难度。

2.实验方法

2.1 材料与方法

2.1.1 样品采集 191份粪便样本采集自山东省青岛市（可改），临床病例表现为腹泻、腹痛、呕吐, 部分患者出现寒战、发热。样品用PBS配制成20%粪便悬液，保存于-80℃。

2.1.2 试剂仪器 TIANamp Virus RNA Kit购自TIANGEN公司，PrimeScript RT Reagent Kit购自TaKaRa公司。

2.2 引物与探针

引物及探针设计如表1所示，由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物探针及序列

2.3 RNA提取

按照TIANamp Virus RNA Kit提取试剂盒步骤进行。4000r/min离心20min后，取上清，用于下一步实验。提取后用PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒进行逆转录。

2.4 常规RT-PCR

2.4.1反应条件 优化筛选最佳条件，总体系为25μl，其中PCR Buffer为2.5μl，Tag酶0.5U，上、下游引物都为1.25μl，dNTP为3.0μl，cDNA为3.0μl，用无菌水补足。步骤为94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循环数为40。

2.4.2灵敏度、特异性检测 对灵敏度进行检测，利用分光光度计进行定量实验，梯度稀释后分别对1-105copies/μl的两种病毒进行RT-PCR检测。对星状病毒、腺病毒等进行检测，分析其特异性。

2.5 荧光定量RT-PCR

2.5.1反应条件 同样选取最佳反应条件，总体系为20μl，其中2Premix Ex Taq 为10μl，50Rox Reference DyeⅡ为0.4μl，上、下游引物都为1.6μl，探针为0.8μl，模板cDNA为2.0μl。反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，循环数为40。最终在60℃条件下检测荧光。

2.5.2标准曲线 用含有GⅠ、GⅡ型诺如病毒目的扩增片段的质粒来制作标准曲线。在紫外分光光度计下检测吸光度，并转换为copies数量。梯度稀释质粒，分别进行PCR检测，实验结束后对收集到的CT值进行统计，绘制标准曲线图。

2.5.3灵敏度、特异性、重复性检测 对灵敏度进行检测，利用分光光度计进行定量实验，梯度稀释后分别对1～105copies/μl的两种病毒进行RT-PCR检测。对星状病毒、腺病毒等进行检测，分析其特异性。对不同浓度病毒进行分析，每个浓度重复5次，计算平均值，标准差等。

3.结果及分析讨论

3.1 结果

3.1.1常规RT-PCR 对GⅠ、GⅡ型诺如病毒的灵敏性及特异性检测中，发现从103-105copies/μl均可检测出条带，最低检出限为103copies/μl。而对星状病毒、腺病毒以及肠道病毒等均无交叉反应，GⅠ、GⅡ型诺如病毒之间也无交叉反应。以上实验证明该方法具有良好的灵敏性及较高的特异性。

标准曲线如图1所示，均呈现出良好的线性关系。图1中左图A，R2=0.996，右图B，R2=0.998，扩增效率分别为101.336%、103.558%。

图1 GⅠ、GⅡ型诺如病毒标准曲线

3.1.2荧光定量RT-PCR 对GⅠ、GⅡ型诺如病毒的灵敏性检测中，发现从102-105copies/μl均有较好的扩增曲线，最低检出限为102copies/μl。在特异性检测中，星状病毒、腺病毒以及肠道病毒等没有信号，而GⅠ、GⅡ型诺如病毒均有相应的荧光信号，且GⅠ、GⅡ型诺如病毒之间也无交叉反应。这也证明了本实验中设计的引物和探针特异性较好。

对荧光定量RT-PCR的重复性实验中，分别对GⅠ、GⅡ型诺如病毒稀释10倍，进行批内、批间重复试验，结果如表2所示，标准差范围为0.10～0.59，变异系数范围为0.43%～2.84%，可见批内、批间重复性良好。

表2 GⅠ、GⅡ型诺如病毒重复性实验

3.1.3 临床样品检测分析 对191份临床样品进行检测，其中常规RT-PCR阳性样本数为142，检出率为74.34%，而用荧光定量RT-PCR的阳性样本为163，检出率有所提高，为85.34%，两种方法检出率有显著差异（P＜0.05）。如表3所示。

表3 两种检测方法对比

3.2 讨论

NV家族病毒种类多，变异多，又缺少相应的动物模型，早期研究只能用电镜检测，但此法灵敏度很低，且技术要求高，过程复杂。随着分子技术的不断发展，新技术方法不断被研发、运用，RT-PCR、ELISA等已被广泛运用，使得诺如病毒的检测方法更为高效、特异。ELISA较电镜法更为灵敏，但检出率较低，且假阳性较多，RT-PCR法则更加快速准确，继承了ELISA的高灵敏性，又降低了假阳性概率，因此广泛运用于诺如病毒的检测中。诺如病毒感染引发的疾病发病、传播较快，会在短时间内爆发，因此需要在较短时间内尽快检测数量巨大的临床样本，利用荧光定量RT-PCR可以达到这一目的。可对人体造成危害的GⅠ、GⅡ型诺如病毒分别有14、17个亚型，而设计出适合的引物和探针尤为重要。对常规RT-PCR检测诺如病毒的引物对比发现，Kojima等对衣壳蛋白保守区的引物设计GⅠ-SKF/GⅠ-SKR及Ⅱ型的相关设计，较为理想，而之前的实时荧光定量RT-PCR引物和探针设计主要是针对 ORF1的聚合酶区段和ORF2的壳蛋白区段。Kageyama设计的引物和探针是针对NV RNA 的 ORF1-ORF2 交界处的N/S结构域设计的，适合用于 NV 的检测与分型，敏感性及特异性较好，灵敏度也较高，可达99%。

本文中采用常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可较好的检测出GⅠ、GⅡ型诺如病毒，且特异性较好。其中，荧光定量RT-PCR检出限比常规RT-PCR提高约10倍。本文中采用的方法与基于Allglo探针的一步法效率没有明显差别。而比二步法的灵敏度高10倍。对191份临床样品进行检测的最终结果显示，常规RT-PCR阳性样本数为142，检出率为74.34%，荧光定量RT-PCR的阳性样本为163，检出率为85.34%，经统计学分析后发现，两种方法检出率有显著差异（P＜0.05）。同时对阳性样本进行测序分析，结果显示都为诺如病毒，证明RT-PCR法较为可靠。但对数量较多的临床样本来说，荧光定量RT-PCR敏感性更高，特异性更强，检测速度更快，同时可以完全闭管，极大的避免了假阳性概率，使得高通量测序变的可行，荧光探针也使该法更有效，省去了酶切分析、探针杂交验证等步骤，建议优先使用。

[1]刘巍,隆文杰,石玲玲,等.应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒[J].应用预防医学,2007,13(3):129-132.

[2]夏体娇,金敏,陈照立,等.荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估[J].解放军预防医学杂志,2013,31(3):200-203.