固体和液体法在支原体检测中的方法学评价

户小均(通讯作者) 马骥 李选靖

（1四川省绵阳市中心医院检验科 四川 绵阳 621000）（2四川绵阳四0四医院检验科 四川 绵阳 621000）

支原体常存在于泌尿生殖道（主要是Uu和Mh），导致非特异性尿道炎（NGU）。致病性支原体对人体上皮细胞具有极强的亲和性支原体定位于人体呼吸道和生殖道黏膜，从而能造成黏膜的局部细胞损伤这可能是其致病原因[1]。现今检测泌尿生殖道支原体的方法主要是培养法、免疫法和PCR法，但免疫法和PCR法操作复杂且价格较高，故目前国内大多数实验室检测Uu和Mh的方法为培养法[2]。培养法分两类，分别为固体培养法和液体培养法，而在国内较常使用液体培养法。液体培养法对实验条件要求不高，且操作简捷，作为WHO推荐诊断NGU的首选方法[3]；传统固体培养法成本相对较高、耗时长，虽有新型固体培养基应用，缩短了培养时间，但也存在真菌污染情况，影响形态观察[4]。由于固体培养法和液体培养法常出现检测结果不一致的现象，本次研究对300例疑似泌尿生殖道支原体感染的标本同时进行固体培养和液体培养，比较两种方法对Uu和Mh的检测价值。

1.材料与方法

1.1 研究对象

300例样本均来自2017年上半年本院疑似生殖道支原体感染者的泌尿生殖道分泌物。男性采用无菌拭子取尿道口1～1.5cm分泌物或尿沉渣（中段尿10～20ml，2000r/min离心10分钟）；女性采用无菌拭子取宫颈口1～1.5cm处分泌物。

1.2 仪器与试剂

所选用的液体培养基为Uu和Mh选择分离培养、鉴定、药敏试剂盒，购自众爱生河北生物科技有限公司；固体培养基Uu和Mh的选择分离培养基，购自众爱生河北生物科技有限公司）。仪器选择普通光学显微镜和隔水恒温培养箱。

1.3 实验方法

标本在收集后尽量在2小时内接种。固体培养：将标本拭子直接滚动连续划线涂布在固体培养基上，并加一片二氧化碳发生片，编号后放入培养箱培养。液体培养：取未接种的培养基液100μl加入阴性对照孔，然后将标本拭子头置于液体培养液内充分洗涤并在瓶壁上挤干拭子，然后各取100μl滴加在除阴性对照孔的其余各孔中，滴加石蜡油覆盖，编号后放入培养箱35～37℃培养，24～48小时后观察结果。

1.4 结果判断

1.4.1液体培养结果判定 鉴定孔无颜色变化且无混浊则为阴性；鉴定孔由黄色变成红色且无浑浊则判定为阳性。若阳性孔出现混浊或鉴定孔阳性而阳性孔为阴性则视为液体培养污染。

1.4.2固体培养结果判定 培养24～48小时后在低倍镜下观察培养基上是否生长支原体属特征菌落，若观察到较大且为油煎蛋状支原体菌落则为Mh阳性；若观察到较小且呈圆形棕褐色支原体菌落则为Uu阳性；若两者都有则为Uu+Mh阳性；若无典型支原体属特征菌落生长则为阴性；有杂菌生长并影响到结果观察的判为固体培养污染。

1.5 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件进行χ2分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2.结果

2.1 固体培养与液体培养阳性检测率

液体培养及固体培养结果见表1、表2，经统计学检验两种培养法对泌尿生殖道支原体检测结果差异具有统计学意义（χ2=5.621，P＜0.05）。

表1 固体培养法与液体培养法检测结果

表2 固体培养法与液体培养法阳性率

2.2 固体培养与液体培养污染率

液体培养及固体培养污染率见表3，经统计学检验差异具有统计学意义，液体培养法污染率高于固体培养法（χ2=10.173，P＜0.05）。

表3 固体培养法与液体培养法污染率

3.讨论

泌尿生殖道支原体检测的常用方法为液体培养法和固体培养法，本研究采用液体培养法和固体培养法来检测300例疑似泌尿生殖道支原体感染的标本，结果显示液体培养法阳性率高于固体培养法，其差异有统计学意义。其原因主要是液体培养法是生化反应，特异性差，Uu或Mh在培养基中生长时，会分解尿素或精氨酸，产生氨气使培养基pH上升，令酚红指示剂由黄色变为红色，从而确定有Uu或Mh生长；然而这种反应不是支原体特有的，当培养液中存在可以分解尿素或精氨酸的其他细菌和真菌时，都会出现阳性反应；而固体培养法特异性高，只有观察到典型的Uu或Mh才能判定为阳性，这就造成了液体培养法阳性率高于固体培养法。此外，根据吴清坛研究报告可得出液体培养法敏感性高于固体培养法，这亦是固体培养阳性率高于固体培养的原因之一；同时，由于固体培养时间过长，若未培养足够的时间，则支原体可能未生长或不明显，这亦会导致固体培养的阳性检测率低。

液体培养对于确诊Uu的假阳性率为10.85%（14/129）；液体培养对于确诊Mh的假阳性率为42.85%（6/14）。可见液体培养法检测泌尿生殖道支原体更易出现假阳性的结果。分析出现假阳性结果的原因主要有两个：液体培养基不能完全抑制或杀灭其他具有耐药性的微生物，而这些微生物恰好能分解尿素和精氨酸，产生氨气致使培养基变红而出现假阳性的结果；某些碱性标本亦会导致培养液由黄色变为红色，继而出现假阳性的结果。

此外，有5例标本液体培养为阴性而固体培养为阳性，这是由于采集的标本支原体量少或标本在培养液中未将支原体充分洗脱下来，导致培养时支原体含量太少，在培养24-48小时内不能产生足够的氨气致使酚红指示剂不变色或颜色变化程度不大，以致于结果判为阴性；标本上携带其它细菌、细胞或真菌导致标本污染，使培养液浑浊视为污染而判定为阴性。此外，液体培养中先滴加抗生素包被的微孔再滴加阳性孔和鉴定孔，若往抗生素包被的微孔滴加培养液时污染了加样枪头且未更换枪头，从而污染了培养液导致培养结果为阴性。

结果显示固体培养污染率小于液体培养，且差异有统计学意义。造成污染的原因可能是：（1）标本问题：若采集的标本上有杂菌、细胞或真菌，使得培养液混浊而将培养结果判为污染；（2）接种时的污染：固体培养接种快捷，接种完加入二氧化碳发生片后立即封闭，大大减少了其他杂菌污染培养基，干扰结果的可能性；而液体培养接种过程中，不仅需要在阳性孔，阴性孔和鉴定孔滴加培养液，还需要在多个以高低浓度抗生素包被的微孔中加入培养液，这样增加了接种时间，加大了杂菌污染培养基的机率。

综上所述，液体培养法操作更方便，附带鉴定和药敏试验能反映支原体感染程度及耐药性，指导临床合理用药，但易漏诊和误诊；固体培养法特异性强，能直观观察支原体典型菌落，污染率小且不易漏诊和误诊，是确诊支原体感染的方法，但培养时间过长。因此，两种方法各有优劣，临床应联合两方法检测支原体，才能有效，快速，准确地检测出是否为支原体感染及感染程度，这对感染早期的确诊以及治疗具有十分重要的作用。

[1]陈忠领，罗凯亮.女性生殖道支原体感染及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2011，32（5）：599-600.

[2]黄秀荣，张群先.液体法和固体法检测泌尿生殖道支原体的效果[J].中国热带医学杂志，2017，17(2)：207-209.32

[3]毛得斌.泌尿生殖道支原体感染检测及药敏分析进展[J].右江医学，2015，43（5）:637-640.

[4]张艳，李苏利.Uu检测方法研究现状[J].临床军医杂志，2014，42（9）:961-963.