猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）新佐剂评估试验

秦守贤 孙 涛

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.申联生物医药（上海）股份有限公司，上海 200241）

合成肽疫苗是一种仅含免疫决定簇组分的小肽，即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫苗，是最为理想的安全新型疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一。

佐剂是与抗原同时或预先注射，可非特异性地增强或改变机体对抗原免疫应答的物质，选择合适的佐剂是疫苗免疫效果的保证。理想的佐剂应能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，稳定且便宜容易生产[1]。

合成肽疫苗是一种新型疫苗，具有免疫原性高、生物安全性好、免疫持续期长、质量稳定性好、可有效区分免疫动物和感染动物的特点[2]。由于合成肽抗原本身分子小，免疫原性弱，需用特定的佐剂来增强其免疫原性。目前，市场上口蹄疫疫苗所用佐剂主要包括ISA 201VG、ISA 206VG、ISA 50V和ISA 50V2，而猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）主要使用的佐剂为ISA 50V2。ISA 50V2佐剂投入生产近4年来，客户对猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的免疫效果持肯定态度，但也有市场反馈合成肽疫苗注射阻力较灭活疫苗大。疫苗的注射阻力和疫苗黏度息息相关，黏度过大可导致注射阻力增大，应激反应增大，降低免疫效果，同时也影响肉制品质量。市场上ISA 50V2佐剂所制成的合成肽疫苗黏度一般在100cP左右，灭活疫苗的黏度一般在30cP左右，合成肽疫苗黏度较灭活大，可能会存在注射困难的现象。

低黏度、良好稳定性、免疫效果好、无副作用一直是合成肽疫苗工艺改进的方向。ISA 50V2佐剂的供应商法国SEPPIC公司，为降低合成肽疫苗的黏度，研发成功了新佐剂ISA 61VG。本试验采用新佐剂ISA 61VG和原ISA 50V2佐剂进行乳化制成猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800），试验新佐剂的乳化后的外观、剂型、稳定性和黏度是否能够达到质量标准的要求，其黏度是否能够有效降低，并探讨新佐剂替代现有佐剂的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水相：内含合成肽抗原多肽2 6 0 0（批号为SL3150621B1D1）、多肽2700（抗原批号为SL2150621B1D1）和多肽2800（抗原批号为SL1150624B1D1）各25μg/ml，申联生物医药（上海）股份有限公司生产；

1.1.2 佐剂：ISA 61VG佐剂，法国SEPPIC公司生产，批号为QP45781；ISA 50V2佐剂，法国SEPPIC公司生产，批号为QP27845；

1.1.3 仪器：FA25剪切乳化机，剪切头（20g、10g），梅特勒-托利多AB204-S分析天平，NDJ-5S型黏度计，LS-POP（8）激光粒度分析仪。

1.2 方法

1.2.1 疫苗配制

（1）50V2佐剂：按现有的猪口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）乳化工艺（水油体积比1：1、乳化流速7000ml/min）制成疫苗。乳化10次。

（2）61VG佐剂：根据前期61VG佐剂乳化参数的筛选试验所确定最优的61VG佐剂乳化工艺参数（水油重量比1：1、乳化流速8000ml/min），使用61VG佐剂乳化制成疫苗。乳化10次。

1.2.2 检测方法与标准

（1）外观：眼观应为乳白色略带黏滞性乳状液。

（2）剂型：油包水型（W/O）。取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，第一滴不计，从第二滴开始，应呈油滴状不扩散。

（3）稳定性：取出待检样品回温至室温（15℃～25℃），吸取疫苗10ml 放入相应的离心管中，于天平称量平衡后以3000r/min离心15min，管底析出的水相体积应不得超过 0.5ml。

（4）黏度：取疫苗100ml，使用黏度计检测，应不大于150cP。

（5）粒径：选取白油作分散剂，以疫苗：白油为1：8至1：12的比例稀释，作为待测样品，使用LS-POP（8）激光粒度分析仪进行检测，D50应为1.24～1.96μm。

2 结果

2.1 外观

样品目测均为乳白色略带黏滞性液体，检测结果均符合产品质量标准（见表1）。

2.2 剂型

样品检测均为油包水型，检测结果均符合产品质量标准（见表1）。

2.3 稳定性

样品离心后管底目测均无水相析出，检测结果均符合产品质量标准（见表1）。

2.4 黏度

通过黏度计检测，ISA 50V2制成的疫苗黏度均小于100cP，ISA 61VG制成的疫苗黏度均小于60cP，检测结果均符合产品质量标准（见表1）。

2.5 粒径

通过激光粒度分析仪检测，ISA 50V2粒径的D50值为1.28～1.81μm，符合企业内控质量标准，而ISA 61VG粒径的D50值为1.74～2.07μm，不符合产品的企业内控质量标准。

3 讨论

（1）ISA 61VG佐剂制成的猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）的外观、剂型、稳定性和黏度均符合质量标准，且ISA 61VG的黏度较ISA 50V2佐剂显著降低。ISA 50V2佐剂制成猪口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度检测结果范围为97.4～98.6cP，平均黏度为98.01cP；ISA 61VG佐剂制成猪口蹄疫O型合成肽疫苗（2600+2700+2800）的黏度检测结果范围为51.4～52.8cP，平均黏度为52.23cP，下降了47%，下降显著（p＜0.01）。

表1 疫苗检测结果统计表

（2）ISA 61VG佐剂的粒径检测结果不符合现有的质量标准（D50范围1.24～1.96μm）。由表3可以看出，ISA 61VG所制得疫苗的D50均值1.90μm比原有佐剂的D50均值1.67μm有所变化，现有的疫苗粒径标准也是根据ISA 50V2佐剂制得疫苗的检测结果所制定的内控标准。粒径检测结果的变化是由工艺的原因导致，还是ISA 61VG佐剂本身粒径就和ISA 50V2佐剂不一致，这需要后续试验数据进行证明。

（3）从试验结果可以看出，新佐剂ISA 61VG制成疫苗的黏度下降显著，ISA 61VG佐剂替代现有佐剂有很大可行性，后续可开展相关的动物免疫试验，来综合评定ISA 61VG佐剂。如能在降低疫苗的黏度的同时，有效地保证动物免疫效果，该佐剂即为目前猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）所需的优良佐剂。

（4）疫苗黏度影响因素包括佐剂种类和用量、乳化时间、水油比等[3]，从本试验的结果来看，疫苗黏度和粒径也存在一定的关联。本试验中疫苗黏度下降了47%，而粒径D50值升高14%，可能具有一定的负相关。粒径可作为疫苗工艺改进的一个新思路，进而探索乳化温度控制、搅拌频率、压力等一系列乳化参数和粒径的关系，有目的尝试提高疫苗粒径，来观察能否达到降低疫苗黏度、提高疫苗质量的效果。

[1] 潘杭君，孙红祥.免疫佐剂的研究进展[J].中国兽药杂志，2004，38（1）：32-37.

[2] 史素云，杨志彪.猪O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和传统灭活疫苗的比较[J].农业开发与装备，2015，（4）：54-56.

[3] 江心华，陈玉文.影响油乳剂疫苗黏度因数的探讨[J].福建畜牧兽医，2010，（2）：18-19.