不同亚型胃食管反流病食管黏膜下层炎症因子变化特点研究

吾布力卡斯木·吾拉木 巴突尔·艾克木 买买提·依斯热依力 刘晓勇克力木·阿不都热依木，3

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）依据内镜表现可分为3种类型：非糜烂性反流病（nonerosive reflux disease，NERD）、糜烂性食管炎（erosive esophagitis，EE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）［1-3］。最新研究［4］证实人类GERD的发生并不是反流物直接“酸蚀”的结果，而是率先从细胞因子介导的T淋巴细胞组织浸润开始，进而发展引起食管黏膜细胞间隙增宽、毛细血管扩张以及食管基底细胞乳突状增生等组织学变化。目前T淋巴细胞的迁移及其对GERD进展的具体机制尚不明确。有报道指出，Th2细胞（type 2 T helper cells）通过细胞因子途径对BE的发展具有重要作用［5-6］，BE组织中Th2细胞因子表达升高可激活特定的信号转导通路，进而引起抗凋亡基因的表达导致凋亡的抑制［7］。本研究拟从Th2相关细胞因子IL-4、IL-6入手，探索GERD（NERD、RE、BE）中代表性的细胞因子并评价其黏膜中病理组织学变化特点。

资料与方法

一、对象

选自2016年12月至2017年12月于新疆维吾尔自治区人民医院住院患者69例，经Gerd Q相关症状量表评分［8］、食管24 h pH监测评估是否符合胃食管反流病（及其亚型）诊断标准，并结合纤维胃镜检查结果将其进行以下分组：BE组、EE组、NERD组及对照组。其中对照组选取Gerd Q相关症状评分表评分＜6分，因胃食管黏膜异位症、食管静脉瘤等其他消化道疾病行内镜检查，而内镜及免疫学诊断无食管黏膜炎症损害的患者。纳入标准：（1）年龄18～70岁；（2）胃镜检查未发现食管、胃占位性病变（对照组除外）。排除标准：（1）食管鳞状上皮癌、食管腺癌等上消化道恶性病变；（2）有上消化道手术或开胸手术史者；（3）检查前1个月内有促胃动力药物、质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂等药物服用史者；（4）怀孕或哺乳期妇女。本研究经本院伦理委员会审核通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

二、方法

1.仪器：石蜡切片机，德国Leitz公司；TC-120智能程控生物组织自动脱水机，湖北泰维科技实业有限公司；TB-718E型组织包埋机，湖北泰维科技实业有限公司；光学显微镜（Eclipse E200），日本尼康公司；-20℃/4℃低温冰箱（青岛海尔公司）；酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；无水乙醇，天津市致远化学试剂有限公司；二甲苯，天津市致远化学试剂有限公司；包埋石蜡，上海懿洋仪器有限公司；苏木素，北京中杉金桥生物技术有限公司；伊红，北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人IL-4、IL-6抗体，美国Abcam公司；免疫组化试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

2.方法：食管组织标本均取自新疆维吾尔自治区人民医院消化内镜中心，于纤维胃镜下夹取食管齿状线以上3 cm处（BE及EE组选取病变明显部位）组织，置于4%中性甲醛液中固定，用于后期包埋蜡块，行HE与免疫组化染色使用。

三、观测指标和评价标准

选择BE、EE、NERD 3种不同亚型胃食管反流病患者作为研究对象，无反流相关疾病者为对照组，通过食管24 h pH监测比较其食管反流特点；对组织标本进行HE染色后根据食管组织炎症评价方法［9］进行评分；免疫组化法检测研究对象食管黏膜中IL-4与IL-6的表达后进行阳性率统计，阳性评分标准：IL-4、IL-6表达于细胞核或（和）细胞浆，着色棕黄色为阳性。根据阳性细胞数占肿瘤细胞的比例进行归类：阳性细胞数＜5%为（-），5%～25%为（＋），＞25%～50%为（＋＋），＞50%为 （＋＋＋）［10］，结果中 （＋）、（＋＋）、（＋＋＋）的总和称阳性。

四、统计学分析

运用SPSS 23.0软件对样本数据进行处理分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，两样本均数比较采用t检验，多组件比较采用方差分析检验比较组间差异；非正态分布计量资料以M（P25，P75）描述，使用秩和检验比较组间差异；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者基本情况

根据患者的临床表现、Gerd Q评分及内镜检查等结果，将其分为3亚组和1对照组：BE组21例，其中男性13例，女性8例，平均年龄（45.72±13.55）岁；EE组25例，其中男性14例，女性11例，平均年龄（52.73±10.4）岁；NERD组13例，其中男性6例，女性7例，平均年龄（49.20±14.76）岁；对照组10例，其中男性14例，女性11例，平均年龄（53.50±9.86）岁。性别分布方面BE组与EE组男性占比略高于其余2组；4组患者一般指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

二、DeMeester评分及食管反流事件分析

食管24 h pH监测中DeMeester评分3组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；NERD组pH≤4（酸反流）次数较其余2组低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；尽管BE组在4＜pH＜7（弱酸反流）总次数、反流事件总次数的比较中略高于EE组和NERD组，但3组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

三、组织学特点

GERD患者食管黏膜上皮有不同程度增厚，棘层上皮细胞数量增加，上皮及黏膜固有层可见炎症细胞不同程度增加，以EE和BE组尤为明显。对照组食管黏膜上皮完整，细胞排列规则整齐，未见炎细胞浸润；EE组上皮细胞可见水肿，上皮细胞间隙增宽，乳突延长，此特点在部分NERD患者中同样存在但并不显著；BE组上皮破坏明显，水肿及基底层增生显著，组织内浸润的细胞有T淋巴细胞、中性粒细胞和一些嗜酸性粒细胞。4组黏膜组织病理学评分BE组与EE组与其余2组相比均明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.05），BE组评分与EE组之间亦有显著差异（P＜0.05），NERD组与对照组间差异不明显（图1）。

四、IL-4、IL-6的表达

采用光镜观察及免疫组织化学技术分别检测4组食管标本中的IL-4表达情况发现，IL-4在4组食管均有不同程度表达，其中对照组表达量最少，随着炎症加深IL-4呈现表达增高趋势，但4组患者间IL-4阳性率的比较并无显著差异（表2）。

IL-6在4组食管中的表达呈现差异，在NERD组和对照组表达量较低甚至不表达，炎症加深使IL-6表达水平升高，在4组患者食管IL-6阳性率的比较中，EE组明显高于对照组，但与NERD组间无显著差异；BE组阳性率与对照组和NERD组之间皆有明显差异（P均＜0.05），NERD组和对照组差异亦不明显（表2）。

表1 不同亚型GERD患者食管酸暴露比较 [M(P25,P75)]

图1 组织炎症评分

表2 各组食管黏膜上皮组织中IL-4和IL-6表达的比较［例（%）］

讨 论

学界关于非糜烂性反流病、糜烂性食管炎和Barrett食管的关系一直存在争议，有观点认为3者病理生理、临床特征、自然预后等皆不同，因此互为独立亚型而不会相互转化［11-12］。然而大量研究也表明，它们可能是同一疾病谱（GERD）中程度递增的病变［13-15］，Pace等［16］对33例监测出酸反流过度的NERD患者随访5年后发现，94.4%（17/18）进展为了EE，而在10年后几乎全部随访者发展为了EE甚至BE。

本研究针对3组不同GERD亚型患者的食管24 h pH监测结果显示，NERD组患者的pH＜4的酸反流次数与DeMeester评分较BE及EE组更低，且差异有统计学意义。尽管酸反流在GERD发病中的作用已受公认，但弱酸和非酸对GERD进展的影响尚无定论。研究表明，NERD患者pH监测特点与GERD其他亚型相比，非酸反流现象明显增加［17］，其反流物主要成分可能包括胆汁、胰腺分泌物等，与本实验结果相符。

组织学评价方面，本实验中各组GERD患者食管黏膜上皮均有不同程度增厚，炎细胞数目在BE组和EE组增加明显，提示炎症水平与内镜下糜烂表现相关；尽管NERD患者内镜检查阴性，但在少量患者中仍发现上皮细胞间隙增宽，乳突延长、食管上皮水肿、棘层上皮细胞数量增加等特点，与先前研究报道［4］一致；Barrett食管黏膜上皮组织内浸润的炎症细胞包括T淋巴细胞、嗜中性粒细胞和一些嗜酸性粒细胞，类似于以往的食管炎报告［18］。

食管黏膜炎症如同所有黏膜糜烂的特点一样，主要以炎细胞（中性粒为主）浸润为主［19］，然而炎细胞的组织浸润究竟是食管炎发生的原因还是其结果目前尚无定论。2016年，Dunbar等［4］在对已治愈的GERD患者食管远端正常组织进行活检时发现，食管黏膜下层存在广泛的T淋巴细胞浸润，并伴有基底细胞的乳突状增生。

近来研究发现Th2通过细胞因子途径对GERD的发展具有重要作用［6］。本实验采用免疫组化法探测3组GERD亚型及正常对照组食管标本中的IL-6水平后发现，其在对照组表达量极低甚至不表达，而炎症程度加深会使IL-6表达水平升高；BE组阳性率与对照组和NERD组之间皆有明显差异；NERD组IL-6表达较对照组略上升。

本研究中IL-4在4组食管均有不同程度表达，其中对照组表达量最少，随着炎症加深IL-4呈现表达增高趋势；统计4组患者IL-4表达阳性率后发现，各组间并无显著差异；血清IL-4水平BE组和EE组均明显高于其余两组，与之前研究［20］相符。Barrett食管中的上皮化生被认为是上皮细胞为应对慢性胃食管反流作出的适应性改变［21］，IL-4表达的升高（我们的结果）支持了这一理论即，作为抗炎性细胞因子，IL-4发挥了其细胞保护作用。

根据本次研究结果我们认为，从缺乏内镜证据的NERD到炎症表现明显的糜烂性食管炎再到出现化生的Barrett食管，酸反流在这一进程中并未明显加重；NERD患者的食管黏膜上皮已出现病理组织学变化，但与正常组织鉴别尚缺乏敏感性；但相比于IL-4，IL-6在不同亚型GERD食管黏膜组织中的差异更为明显。本研究受临床资源、研究周期等因素约束，未能收集足够多的样本纳入研究，结论尚不具有代表性，今后尚需要通过增加动物实验、细胞实验等方法，寻找更多有力的佐证以尽早探明人类胃食管反流病的发病之谜。