竹叶兰内生真菌的分离鉴定及其抗氧化活性研究

宋新月，汤冰雪，邱君志，刘美凤

（1.福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002）（2.华南理工大学化学与化工学院，广东广州 510640）

植物内生菌(endophytes)一词最早是由De Bary在1886年首次提出，是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、但不会引发宿主植物表现出明显的感染症状，并与宿主植物协同进化的一类具有丰富多样性的微生物类群，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。自1993年Stierle等[1]首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产生紫杉醇的内生真菌后，关于植物内生菌的分离与鉴定立即成为国内外微生物研究领域的一大热点。药用植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，其活性次级代谢产物具有良好的开发利用价值[2]。已有学者从无花果叶中分离获得1株具有抗菌活性的炭角菌属Xylaria sp.内生真菌，发现其次级代谢产物对3种肿瘤细胞具有较强的体外抑制活性[3]；从内生真菌Preussia sp.的发酵液中获得了具有抗肿瘤活性的次级代谢物产物Spiropreussione A[4]。某些药用植物内生真菌不仅具备合成宿主植物次级代谢产物的能力，还能够独立产生丰富的、结构新颖的次级代谢产物，例如抗生素等[5]，因此利用药用植物内生真菌替代稀有药用植物来开发新药具有重要的科学意义和应用价值[6]。

自由基作为机体的正常代谢产物，在平衡状态下，其在抗菌、消炎和抗肿瘤等方面具有重要作用；一旦平衡被打破，如机体被某些外源药物侵害，自由基便会产生强大的反作用，迫使组织细胞受损，进而引起机体病变，甚至死亡[7]。目前，国内外研究发现自由基与肿瘤、衰老、心脑血管疾病等多种人体疾病的发生密切相关[8]。已有研究证明，一些植物内生菌具有良好的抗氧化活性[9,10]。因此，植物内生菌的天然活性物质将为寻找高效、廉价及低毒的新型抗氧化剂提供一种新思路。

竹叶兰(Arundina graminifolia)为兰科竹叶兰属植物，别名长杆兰、草姜、文哈海（傣名），分布于热带和亚热带地区，用于治疗尿路感染及毒蛇咬伤等，收载于《中药大辞典》中。但由于其地域分布性强，并且产量有限，所以从其内生菌中获得具有良好生物活性的次级代谢产物来代替稀有药用植物竹叶兰是一条便捷而有效的途径。当前国内外学者对竹叶兰的研究主要集中在其化学成分[11,12]、药理研究[13,14]以及人工栽培等方面[15,16]，有关竹叶兰内生菌的研究尚未见报道。因此，本实验对采自云南西双版纳地区及广西百色地区的竹叶兰植物体的根、茎和叶片中的内生菌进行了分离和鉴定，同时探讨了部分竹叶兰内生真菌的抗氧化活性，为后续进一步研究竹叶兰内生菌及其生物活性成分提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜的竹叶兰植株采集于中国云南省西双版纳地区以及广西省百色市，均由云南药物研究所邱斌教授对其种属鉴定，凭证标本（YN20170313及GX2170323）存入华南理工大学化学与化工学院制药工程系。

1.2 培养基的配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：取新鲜马铃薯200 g，洗净，去皮，切成小块，放入适量的水中煮沸30 min，用8层纱布过滤后置于1000 mL烧杯中，向其中依次加入葡萄糖和琼脂各20 g，加热搅拌至琼脂完全融化，补加蒸馏水至1000 mL。趁热将其分装于5个250 mL三角瓶中，每瓶装200 mL培养基，用8层纱布包住瓶口，2层报纸封口并写好标签，于121 ℃下高压灭菌20 min后备用。

1.3 实验材料竹叶兰内生菌分离纯化及保存

将采集的竹叶兰植株储存于4 ℃环境中，且储存时间最好不超过2周。选取新鲜且植株样品完好的竹叶兰，用无菌水洗涤除去其表面泥土。采用组织切块培养法[17]，在无菌条件下，用无菌解剖刀将竹叶兰的根和茎分别切成厚度为0.5 cm的切块，将叶片切成面积为0.5 cm×0.5 cm大小的切片。把切好的材料先置于75%乙醇溶液中浸泡3 min，用无菌水冲洗3次后，置于0.1%升汞溶液中，将根和茎漂洗2 min，叶片漂洗1 min，然后用无菌水冲洗5次。用灭菌的滤纸片吸干竹叶兰组织切块表面的水分，将其消毒后的新鲜剖面与含氨苄青霉素（100 μg/mL）的PDA培养基平板相贴合，每个PDA培养基平板上放置3～4个竹叶兰组织切块，最后将其置于 28 ℃恒温培养箱中倒置培养4～7 d。取最后一次清洗竹叶兰组织切块后的无菌水，用涂布棒涂布于含抗生素的 PDA培养基平板上，28 ℃恒温培养4～7 d，观察是否有其他杂菌长出，以此作为无菌操作参照组。

待竹叶兰组织切块或切片的切口处有菌落长出，根据菌落颜色、形态差异和长出菌落时间长短的不同，分别挑取各菌落边缘形态各异的菌丝，接种于 PDA培养基平板上进行纯化再培养。培养数日后，观察并记录菌落的生长形态。对得到的菌株进行多次纯化后编号，并转接至PDA斜面培养基上，在28 ℃恒温培养箱中培养4～7 d后，放入4 ℃冰箱中长期保存。

1.4 竹叶兰内生菌的形态学观察

将已分离纯化的内生菌接种于 PDA培养基平板上，28 ℃恒温培养7～10 d。采用插片法，在各菌株的培养平板上以斜 45 °角插入无菌盖玻片 2～3枚，在28 ℃下继续培养3～5 d，取出盖玻片，制成载片标本，在倒置荧光显微镜下依次从低倍镜向高倍镜观察，获取各菌株在油镜下（100×10倍）的显微图片。

1.5 竹叶兰内生菌DNA分子鉴定

从 PDA培养基平板上刮取已得到分离纯化的内生菌菌株的菌丝体，加入DNA提取裂解液300 μL，涡旋振荡后，在65 ℃下水浴30 min，再加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），涡旋混匀，13000 r/min离心5 min。取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀后，13000 r/min离心5 min。弃上清液，加入70%乙醇混匀，13000 r/min离心1 min。弃乙醇，倒置离心管，晾干。之后加入30 μL ddH2O，溶解DNA，即可进行下游PCR扩增或者在-20 ℃下保存。

提取内生菌基因组 DNA后，用通用引物ITS4/ITS5来扩增18S rRNA基因片段，PCR反应体系（50 μL）：10 倍缓冲液 5 μL，dNTPs 5 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 稀释50倍后取1 μL（对照组加ddH2O），ddH2O 36 μL。PCR扩增条件为：94 ℃变性 3 min；94 ℃变性 40 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸90 s，如此处理35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经切胶纯化回收，加入去离子水溶解后送到广州基迪奥生物科技有限公司进行测序。

1.6 部分竹叶兰内生菌抗氧化活性测试

1.6.1 竹叶兰内生菌发酵液提取物对DPPH自由基的清除活性

对竹叶兰内生菌 YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及BSRF-3的发酵液提取物进行抗氧化活性的测定。以上内生菌的发酵液均用乙酸乙酯萃取3次后蒸发旋干得发酵浸膏[18]，再将各样品用无水乙醇溶解，分别配制成0.0125 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL和0.2 mg/mL的待测样品液。

DPPH自由基清除能力测定参照Atoui[19]方法，并略作改动。（1）精确移取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH（DPPH溶液要现用现配，注意避光保存）与 2 mL供试液混合，室温下放置30 min，于517 nm处测吸光度，记为As；（2）精确移取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH与2 mL无水乙醇混合，室温下放置30 min，于517 nm处测吸光度，记为Ao；（3）精确移取2 mL无水乙醇与2 mL供试液混合，室温下放置30 min，于517 nm处测吸光度，记为Ac；以Vc溶液作为阳性对照。每个样品做2个平行样，清除率计算公式如下：

国家层面的媒体融合战略的下一步是县级融媒体中心建设，推动党媒公共平台与基层融媒体中心共享资源。基层媒体融合关乎县域治理与稳定，其重要性不容小觑。这也是本文所提到的主流媒体平台化建立新的内容生态的重要步骤。区域型主流媒体的融合转型是地方社会政治经济文化变革的一个缩影，同时伴随着舆论引导生态和社会治理平台的重塑。传播方式的变革给人们的信息使用行为带来极大影响，在消费升级和供给侧改革中寻找新的发展空间和变革动力，加快构建媒介融合生态圈，进一步提升区域型主流媒体对地方社会的实际影响力，是深化传统媒体融合之路的重要课题。

DPPH清除率S%=1-(As-Ac)/Ao×100%

1.6.2 竹叶兰内生菌发酵液提取物对Fe3+还原能力的测定

Fe3+还原能力的测定是根据Wang[20]的方法，并略有改动。取2.5 mL各菌株不同浓度的样品液，与2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS缓冲液和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液混合，50 ℃水浴20 min后迅速冷却至室温，再向其中加入2.5 mL 10%的三氯化钾溶液，用微孔滤膜器过滤后，取上清液5 mL，向其中加入4 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混匀后，静置10 min并于700 nm处测定吸光度，记为A。以Vc溶液作为阳性对照。每个样品做2个平行样。

1.6.3 竹叶兰内生菌发酵液提取物清除 H2O2的能力

清除过氧化氢能力(PSC)分析参照Du[21]等人报道的方法，并稍有调整。取4.0 mL各菌株不同浓度的样品，向其中加入1.0 mL由pH 7.4的PBS缓冲液调配的1%的过氧化氢溶液，静置反应10 min后，于230 nm处测吸光度值，记为 Ax；以蒸馏水调零，记为 Ao；以Vc溶液作为阳性对照。每个样品做2个平行样，清除率计算公式如下：

H2O2清除率 Q%=(Ao-Ax)/Ao×100%

1.7 数据分析

采用SPSS 11.0统计分析软件，实验结果用平均值±标准差来表示，数据统计分析以单向方差分析法进行差异显著性检验分析，以p<0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 竹叶兰内生菌的分离和纯化结果

从提取的竹叶兰内生真菌基因组DNA中，利用ITS rRNA通用引物ITS4/ITS5成功地扩增出了单一清晰的条带，且所有序列长度均在500～750 bp之间，没有拖带现象。

研究认为，菌种基因序列的BLAST比对结果的同源性若大于 97%，则可判定为同一物种；若小于97%，则不能判定其一致性。在GenBank数据库中的BLAST分析比对结果显示（见表1），本实验所分离得到的 16株叶兰内生真菌，经鉴定 YNLF-1为Phanerochaete sp.，YNLF-3 为 Phyllosticta capitalensis，BSSF-3 为 Diaporthe sp.，BSRF-1 为 Hypoxylon sp.，BSRF-2为Nodullsporium sp.，BSRF-3为Chaetomium nigricolor，其余10种菌株均为Colletotrichum sp.。结果显示竹叶兰内生真菌的优势种为刺盘孢属。由于YNLF-1的比对结果较低，为93%，表明该菌株很大可能是Phanerochaete sp.的新种，后续我们还将会对其作进一步的分析鉴定。

2.2 竹叶兰内生菌的形态学观察结果

实验中得到的 16种内生菌菌株菌落表面均呈丝状或绒毛状，因此可初步判断其全部为真菌。我们采用FIM倒置荧光显微镜（100×10倍）对该16种内生菌株分别进行形态学观察（图1），特征描述详见表2。

表1 两种产地竹叶兰植株的不同部位内生菌分离及鉴定结果Table 1 Isolation and identification of endophytes in different parts of Arundina graminifolia in two producing regions

表2 竹叶兰内生真菌的形态学特征Table 2 Morphological characteristics of endophytes in Arundina graminifolia

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图1 竹叶兰内生真菌的形态学特征（菌落平板正面观察图及对应菌株在100×10倍下倒置荧光显微镜图）Fig.1 Morphological characteristics of endophytes in Arundina graminifolia (the positive view of the colony plate and the corresponding strain were observed using an inverted fluorescence microscopy at 100 x 10 times)

2.3 部分竹叶兰内生菌的抗氧化活性的评价

本次实验中我们选择了5种具有代表性的竹叶兰内生真菌，分别为YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及 BSRF-3。对以上菌株进行摇瓶发酵培养后，得其发酵液萃取物，各个样品依次进行对DPPH自由基的清除能力的测定、对Fe3+还原能力的测定及清除H2O2能力的测定。结果表明（图2），该5种竹叶兰内生真菌均有不同程度的抗氧化活性，其中菌株BSSF-2的抗氧化活性最强，其在0.2 mg/mL的浓度下对DPPH自由基的清除率高达90.25%左右，对Fe3+的还原能力最强，对 H2O2自由基的清除率可达 81.08%；菌株YNLF-1也具有较强的抗氧化活性，其在 0.2 mg/mL的浓度下对 DPPH自由基的清除率可超过 80%，对Fe3+的还原能力稍弱于BSSF-2，对 H2O2自由基的清除率也接近70%。

图2 5种竹叶兰内生真菌发酵液的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of five kinds of endophytic fungi in the fermentation broth of Arundina graminifolia

2.4 抗氧化优势菌种BSSF-2的系统发育分析

将竹叶兰内生菌 BSSF-2的 ITS序列结果与GenBank数据库进行比对分析，采用MEGA 6.0软件对抗氧化优势菌种BSSF-2构建系统发育树（图3）。结合该菌株形态学特征，鉴定菌株BSSF-2为刺盘孢属的喀斯特炭疽菌(Colletotrichum karstii)。

图3 抗氧化优势菌BSSF-2与GenBank中参考菌株ITS rDNA构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequences of antioxidative dominant bacteria BSSF-2 and its GenBank allies

3 结论

3.1 本研究通过对两种产地的竹叶兰植株的内生菌进行初步的分离及纯化，发现在不同地区的竹叶兰中分离得到的内生菌其数量、种类均有显著差异，其中产于广西的竹叶兰中分离出的内生菌数量及种类明显多于产于云南的竹叶兰内生菌，反映出植物内生菌的种类和数量可能与宿主植物的生长环境有关，例如当地的温度、空气湿度和土壤成分等。本实验首次从药用植物竹叶兰中分离得到16株内生菌，经形态学观察和ITS基因序列同源性分析，发现这些菌株全部归属于真菌，表明内生真菌是竹叶兰内生菌的重要组成部分，其中刺盘孢属真菌为竹叶兰内生真菌的一大优势种。

3.2 近年来国内外已经有学者从数十种药用植物中分离出了内生菌，并从这些药用植物内生菌中获得了和宿主植物相同或相似的天然活性成分。植物内生真菌中存在大量具有良好抗氧化活性的天然产物，包括酚酸类、异苯并呋喃、生物碱、聚酮、黄酮、芳香醚和萜类等，这些结构多样生物活性物质将成为开发新型天然抗氧化剂的重要来源。本实验通过对5种竹叶兰内生真菌 YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及BSRF-3抗氧化活性进行测定，发现菌株 BSSF-2及YNLF-1具有较强的抗氧化作用（其中对DPPH自由基的清除率≥80%），经鉴定菌株 BSSF-2为Colletotrichum karstii，YNLF-1 为 Phanerochaete sp.。本研究结果表明，分离药用植物内生菌不仅是寻找未知新菌种的一个重要途径，同时也将为新型抗氧化药物的开发提供新思路。至于内生菌与其宿主植物之间具体存在怎样的互作关系，内生菌与宿主植物生长及其代谢产物的产生存在何种联系，尚需我们深入研究。

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