不同品种荔枝果肉细胞抗氧化及抗增殖活性评价

刘冬，刘仁斌，孙海燕，吴丹玲

（1.深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室，广东深圳 518055）（2.十堰市人民医院中医科，湖北十堰 442000）

人体新陈代谢的过程中产生自由基，在病理条件下，人体自由基产生系统和清除系统失去平衡，引起自由基过剩，过剩的自由基会引起体内的生物大分子（如脂类、蛋白质和DNA）的氧化损伤，导致心血管病、白内障和早老性痴呆等慢性退行性疾病的发生，甚至诱发肿瘤等恶性疾病[1]。实验研究和流行病学均表明，水果蔬菜中含有的多酚类、黄酮类等抗氧化物果蔬食品可有效预防慢性退行性疾病和肿瘤的发生质能有效清除人体内过剩的自由基，膳食摄入足量的[2]，因此，水果蔬菜的抗氧化和抗增殖活性评价一直是国内外食品科技工作者关注的热点领域。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我国南方地区主要的特色水果，除含有多种维生素、有机酸和大量游离氨基酸外，也富含多酚和活性多糖等生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗菌、抗炎症及增强免疫力等多种生理功能[3]。迄今，国内外对荔枝抗氧化作用及抗氧化活性成分的研究主要集中在荔枝核、荔枝壳好荔枝果肉多糖上，对荔枝果肉多酚的研究主要集中在多酚的分离鉴定和体外化学抗氧化活性方面[3]。Zhang等[4]测定了我国南方地区13种荔枝品种果肉总多酚、总黄酮和其中6种果肉多酚的含量，并采用FRAP法和DPPH自由基清除法评价了不同荔枝品种果肉的体外化学抗氧化活性；Lv等[5]分析了妃子笑等三种荔枝果肉中总多酚、总黄酮和其中的13种多酚单体的含量，并采用ABTS和DPPH自由基清除法评价了其体外化学抗氧化活性。

食物抗氧化活性评价方法主要有体外化学法、动物体内实验法和细胞学方法三种。体外化学评价方法中的ORAC（Oxygen radical absorbance capacity）法由于实验条件接近人体生理环境，因此被视为目前抗氧化活性体外化学评价方法中最为准确的方法。但由于ORAC评价法是在体外试管中进行的，不能体现食物中抗氧化剂的肠道消化吸收特性、生物利用度、新陈代谢和细胞生理条件等体内生理因素[6]，评价结果能否用于预测抗氧化剂在人体内抗氧化能力，仍然广受质疑。许多研究也表明，许多在体外具有很高ORAC值的物质，在体内甚至检测不到抗氧化效果[7]。采用动物模型体内评价食物的抗氧化能力是最准确的方法，但由于耗时、耗药量大，不适合用于食物抗氧化能力的初始阶段筛选研究。Wolfe等[8]建立了一种基于人肝癌细胞（HepG2）模型的抗氧化活性细胞学定量分析方法（cellular antioxidant activity assay，CAA），该方法由于测定条件与体内生理条件相似且部分体现了抗氧化物质的吸收代谢特征，测定结果具有较高的生物相关性，因而成为当前评价食物抗氧化活性的广泛使用的方法。

综合分析文献报道，迄今对荔枝果肉的抗氧化活性评价主要采用体外化学法，利用细胞模型全面评价不同荔枝品种果肉的抗氧化活性的研究鲜见报道，而有关荔枝果肉的抗增殖活性研究则未见报道。因此，本研究拟采用细胞模型对我国南方地区主要种植的十种荔枝品种果肉的细胞抗氧化和抗增殖活性进行全面系统的评价，研究结果可为进一步探索荔枝果肉的保健功能与活性成分间关系提供基础参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10种荔枝鲜果均在最佳食用时间采摘并进行抗氧化、抗增殖活性评价研究。其中，妃子笑、桂味、糯米糍、淮枝和黑叶产自广东省深圳市，小米枝、鸡咀荔、白蜡、蜜糖糍产自广东省湛江市，荔枝王产于海南省海口市。

HepG2人肝癌细胞，购自美国 ATCC公司；Folin-ciocalteu试剂（AR）、没食子酸（AR）、儿茶素（AR）、荧光素钠盐（AR）、Trolox（AR）、2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA，AR）、二甲基亚砜（DMSO，AR）、2,2’-偶氮二异丁基脒盐酸盐（AAPH，AR）、Hepes（AR）、HBSS、槲皮素（HPLC）、青链霉素混合液（100×）、庆大霉素、氢化可的松、胰岛素、非必需氨基酸（100×）、台盼蓝（0.4%）、WME（1×）、FBS、胰酶，均购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞培养瓶、96微孔板，购自美国Corning公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HR25850型组织捣碎机，珠海飞利浦电器有限公司；T25 digital ULTRA-TURRAX高速匀浆机，德国IKA公司；5810 R型冷冻离心机，德国Eppendorf公司。HERA Cell 240型CO2细胞培养箱，美国Thermo公司；BHC-ⅡA2生物安全柜，苏净安泰空气技术有限公司；DM IRB型荧光倒置显微镜，德国Leica仪器有限公司；Spectra Max M2型连续光谱密度荧光检测仪，美国Molecular公司。

1.3 实验方法

1.3.1 荔枝果肉总多酚提取

荔枝果肉总多酚提取方法参考吴丹玲等[9]的方法。取冻存荔枝，去梗、去皮、去核后，按料液比1:2（m/V）加入90%浓度的冷丙酮，组织捣碎机（预冷）捣碎3 min，高速匀浆机12000 r/min匀浆5 min（冰浴），匀浆液在4 ℃、12000 r/min下离心10 min，提取三次，合并离心上清液于45 ℃条件下真空旋转蒸发至干，以超纯水重溶解浓缩物，得荔枝果肉多酚提取液，分装后置于-80 ℃冰箱贮存待测。

1.3.2 总多酚含量测定

多酚含量测定采用Folin-ocalteu法[10]。分别取提取液及不同浓度的没食子酸标准溶液100 μL至已加入 400 μL去离子水的试管中，摇匀，加入 100 μL Folin-Ciocalteu试剂，混匀，放置6 min，加入1 mL 7%浓度的Na2CO3溶液和0.8 mL去离子水，混匀，室温下反应90 min，在酶标仪上于760 nm测定吸收值。总酚含量用 mg没食子酸当量/100 g鲜果（mg GAE/100 g鲜果）表示。

1.3.3 总黄酮类含量测定

黄酮类含量测定采用氯化铝-亚硝酸钠比色法[10]。分别取提取液及不同浓度的儿茶素标准溶液2 mL到试管中，加入75 μL 5%浓度的NaNO2溶液，混匀静置6 min后加入150 μL 10%浓度的AlCl3·6H2O溶液，静置5 min。加入0.5 mL的1 mol/L的NaOH溶液，再加入去离子水使总液量达到3.0 mL，混匀后立刻在酶标仪上于510 nm下测定吸收值。总黄酮类含量用mg儿茶素当量/100 g鲜果（mg GE/100 g鲜果）表示。

1.3.4 化学抗氧化活性测定

荔枝果肉化学抗氧化活性测定采用氧自由基吸收能力（ORAC）法[11]。分别精确移取20 μL的磷酸缓冲液（空白）、不同质量浓度的样品液或Trolox标准液于96微孔板的相应孔中，再将该96孔板置于已预热至37 ℃的酶标仪中，孵化10 min后按200 μL/孔加0.96 μmol/L的荧光素钠盐溶液，再于酶标仪中37 ℃孵化20 min后，按20 μL/孔加入119 mmol/L AAPH溶液，最后于激发波长485 nm，入射波长520 nm下立即读数，每4.5 min进行一次读数，共检测2.5 h。化学抗氧化性活性（ORAC）值用μmol Trolox当量/100 g鲜果（μmol TE/100 g鲜果）表示。

1.3.5 细胞培养

参照万红霞的方法[10]。HepG2人肝癌细胞用生长培养基（1×WME培养基含5%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、5 μg/mL胰岛素、0.05 μg/mL氢化可的松、50 U/mL青霉素、50 μg/mL链霉素和100 μg/mL庆大霉素）在37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养，本实验用细胞为12～35代之间。

1.3.6 细胞毒性实验

采用亚甲基蓝染色法[10]。100 μL的HepG2单细胞悬液接种到 96微孔透明板中（4×104个/孔），5%CO2、37 ℃培养24 h后，吸出生长培养基，1×PBS清洗贴壁细胞，加入100 μL不同浓度的荔枝多酚提取物（不同浓度提取物用生长培养基稀释制备），设空白对照组（只加入生长培养基）。5% CO2、37 ℃培养24 h，吸出提取物，1×PBS清洗贴壁细胞，加50 μL/孔亚甲基蓝溶液（1×HBSS含 1.25%戊二醛和 0.6%亚甲基蓝），5% CO2、37 ℃培养60 min，吸出亚甲基蓝溶液，将微孔板轻轻浸入去离子水中清洗三次至洗净细胞表面吸附的染料。将96孔板倒置在纸巾上控干水分，加100 μL/孔洗脱液（含49% 1×PBS、50%无水乙醇、1%冰醋酸）。将96孔板室温旋转震荡20 min，置于多功能酶标仪中测定570 nm处的吸收值。如果样品组比对照组的吸收值显著性减少（p<0.05）即判断为水果提取物有细胞毒性。

1.3.7 细胞抗氧化活性测定

荔枝果肉的细胞抗氧化活性评价采用Wolfe的方法[8]。将100 μL对数生长期的HepG2细胞培养物接种到96孔黑壁透明底板中（6×104个/孔），于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，移去残余生长培养基，1×PBS 清洗1 次。加入100 μL 用处理培养基（1×WME培养基含 2 mmol/L的 L-谷氨酰胺、10 mmol/L的Hepes和25 μmol/L的DCFH-DA）配制的不同稀释浓度荔枝果肉多酚提取物和槲皮素标准液，空白组和对照组用处理培养基替代样品提取液。37 ℃、5% CO2条件孵育1 h后，移去残余处理培养基，然后加入100 μL/孔 1×PBS 清洗一次，加入 100 μL/孔 600 μmol/L 的AAPH溶液（空白组用含10 mmol/L Hepes的HBSS溶液处理），立即于发射波长538 nm、入射光波长485 nm条件下测定每孔荧光值，每5 min测定，共测定1 h。细胞抗氧化活性（CAA值）以μmol槲皮素当量/100 g鲜果（μmol QE/100 g鲜果）表示。

1.3.8 细胞抗增殖实验

荔枝果肉的抗增殖活性评价采用万红霞的方法[10]。取100 μL对数生长期的HepG2细胞接于96孔白板中（2.5×104个/孔），于 37 ℃、5% CO2下培养 4 h后，移去残余生长培养基，1×PBS清洗1次。加入100 μL用生长培养基配制的不同浓度（须在无细胞毒性浓度范围内）荔枝果肉多酚提取物和对照组提取液（对照组提取液为用去离子水替代荔枝果肉样品的提取液），于37 ℃、5% CO2条件下培养96 h，按上述细胞毒性实验方法测定吸收值。荔枝果肉抗细胞增殖活性分别用细胞增殖抑制率（%）和半抑制浓度（IC50，mg提取物/mL）表示。

1.4 数据处理

每个样品3次重复实验，实验结果表示为平均值±SD，实验数据的显著性检验和相关性分析分别运用SPSS 13.0统计软件的one-way ANOVA法和双变量相关进行分析，相关性用Pearson相关系数r表示，p<0.05视为有显著性。

2 结果与讨论

2.1 10种荔枝品种果肉总多酚和总黄酮类含量比较

多酚是人体摄入抗氧化剂的最丰富的来源，总多酚含量也是衡量食物抗氧化能力的最基础指标[15]。10种荔枝品种果肉总多酚含量如表1所示，可见，荔枝品种不同，多酚含量也不同，多酚含量最高的妃子笑是最低的淮枝的2.02倍。迄今，国内外研究者已从荔枝果肉中分离鉴定出没食子酸、咖啡酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素A2、原花青素B2、A型原花青素三聚体、B型原花青素二聚体、B型原花青素三聚体、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁、芦丁-鼠李糖、香蜂草苷、香蜂草苷-鼠李糖、山萘酚-芸香糖-鼠李糖苷、异鼠李素-3- O-芸香糖甙、异鼠李素-芸香糖-鼠李糖苷、山萘酚-芸香糖苷、原天竺葵素和原飞燕草素等 21种多酚类化合物[3,4,12]。温叶杰等[13]的研究表明，荔枝果肉多酚提取物中以黄酮类化合物含量为主，其中槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷含量最高，其次是原花青素B2和表儿茶素，三种黄酮类化合物含量总和占荔枝果肉多酚总含量的72.05%。从表1也可看出，不同品种荔枝的果肉黄酮含量有较大差异，黄酮含量最高的妃子笑是最低的淮枝的2.13倍，且多酚与黄酮含量之间呈现极显著的相关性（r值0.926，p<0.01）。

表1 10种荔枝品种果肉总多酚和总黄酮含量Table 1 Total phenolics and flavonoids in pulp from ten litchi cultivars

2.2 10种荔枝品种果肉化学抗氧化活性比较

图1 10种荔枝品种果肉化学抗氧化（ORAC）活性（平均值±SD，n=3）Fig.1 ORAC valus of pulp of ten litchi cultivars (mean±SD,n=3)

利用ORAC法对10种荔枝品种果肉的抗氧化活性进行的评价（图 1）表明，妃子笑具有最大的化学抗氧化活性ORAC值（1895.37±235.68 μmol TE/100 g），其后 ORAC值由大到小的顺序是小米枝（ 1733.37±154.74 μmol TE/100 g ）、 黑 叶（ 1410.44±192.81 μmol TE/100 g）、 鸡 咀 荔（ 1355.26±189.49 μmol TE/100 g ）、 白 蜡（ 1342.18±130.27 μmol TE/100 g）、 糯 米 糍（ 1301.96±42.94 μmol TE/100 g ）、 荔 枝 王（ 1282.31±144.72 μmol TE/100 g）、 蜜 糖 糍（1244.19±142.00 μmol TE/100 g）、桂味（977.00±51.71 μmol TE/100 g）、淮枝（907.84±128.21 μmol TE/100 g）。许多研究都表明，食物的抗氧化活性（ORAC值）与总多酚含量间有显著的正相关性[11,14,15]。本文的研究也表明，荔枝果肉ORAC值与多酚和黄酮含量之间具有极显著的正相关性（r值分别为 0.984和 0.903，p<0.01）。

2.3 10种荔枝品种果肉细胞抗氧化活性比较

图2 10种荔枝品种果肉细胞抗氧化（CAA）活性（平均值±SD，n=3）Fig.2 CAA valus of pulp from 10 litchi cultivars (mean±SD,n=3)

采用CAA方法对10种荔枝品种果肉的细胞抗氧化活性评价表明（图2），妃子笑具有最大的细胞抗氧化活性CAA值（13.17±1.27 μmol QE/100 g），其后由大到小的顺序依次是小米枝（11.42±0.30 μmol QE/100 g）、鸡咀荔（7.97±0.69 μmol QE/100 g）、白蜡（7.45±0.10 μmol QE/100 g）、荔枝王（7.42±0.75 μmol QE/100 g）、糯米糍（6.10±0.60 μmol QE/100 g）、蜜糖糍（5.58±0.40 μmol QE/100 g）、黑叶（4.99±0.56 μmol QE/100 g）、桂味（4.45±0.36 μmol QE/100 g）、淮枝（3.78±0.25 μmol QE/100 g），最大是最小的3.78倍。Wolfe等[11]分析了25种水果CAA值与总多酚含量和ORAC值之间的相关性表明，水果多酚含量与CAA值、ORAC值与CAA值之间都有良好的正相关性（r值分别为 0.890和0.823，p<0.05）。Song等[14]对27种蔬菜的CAA值与总多酚含量和ORAC值之间的相关性研究则表明，蔬菜多酚与 CAA值之间呈现良好的正相关性（r值0.702，p<0.05），但ORAC值与CAA值之间正相关性较弱（r值0.586，p>0.05）。本文的研究表明，荔枝果肉的CAA值与总多酚含量、总黄酮含量、ORAC之间都有显著的正相关性（r值分别为 0.907、0.929、0.927，p<0.01），而且CAA值与黄酮含量之间正相关性最大，说明荔枝果肉多酚中起细胞学抗氧化活性的主要成分可能是黄酮类化合物。Su等人[16]研究表明，荔枝果肉中细胞抗氧化活性的主要黄酮类物质是槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、原花青素 B2、表儿茶素和芦丁，其中槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷具有最强的细胞抗氧化活性。

2.4 10种荔枝品种果肉抗肿瘤细胞增殖活性比较

图3 10种荔枝品种果肉细胞增殖抑制率（平均值±SD，n=3）Fig.3 Antiproliferative activities of pulp from 10 litchi cultivars(mean±SD, n=3)

图4 10种荔枝品种果肉IC50值（平均值±SD，n=3）Fig.4 IC50 of pulp from 10 lichi cultivars (mean±SD, n=3)

10种荔枝品种果肉抗HepG2增殖活性实验结果如图3和图4所示，可见10种荔枝果肉对HepG2细胞增殖都有较强的抑制作用，其中妃子笑的抑制作用最强（IC50达到 11.41±0.38 mg/mL），其次是小米枝（20.23±1.13 mg/mL）、白蜡（30.51±3.04 mg/mL）、桂味（30.89±0.84 mg/mL）、淮枝（32.94±4.79 mg/mL）、蜜糖糍（43.85±6.17 mg/mL）、荔枝王（45.59±4.36 mg/mL）、鸡咀荔（48.10±4.73 mg/mL）、黑叶（50.56±1.50 mg/mL）、糯米糍（63.10±4.69 mg/mL）。10种荔枝品种果肉提取物对HepG2细胞的抗增殖活性（IC50）与多酚含量、黄酮含量、ORAC和CAA值之间均呈现较弱的负相关性（r值分别为-0.404、-0.539、-0.433和-0.608，p>0.05），说明不能简单用食物多酚含量、黄酮含量或抗氧化作用来解释其抗增殖作用，提示可能某些特殊酚类单体或其协同作用在抗肿瘤细胞增殖过程中发挥主要作用[17,18]。因此，需要进一步开展更深入的研究，以探明这些起抗增殖活性的多酚类单体及其协同作用机制。

3 结论

本课题对我国岭南地区常见 10种荔枝品种的果肉的细胞抗氧化活性和抗肿瘤细胞增殖活性进行了比较研究。研究表明，荔枝果肉多酚含量、黄酮含量、化学抗氧化活性、细胞抗氧化活性和抗肿瘤细胞增殖活性随荔枝品种不同而不同。荔枝果肉的CAA值与总多酚含量、总黄酮含量、ORAC之间都有显著的正相关性（p<0.01），且CAA值与黄酮含量之间正相关性最大，说明荔枝果肉多酚中起细胞学抗氧化活性的主要成分可能是黄酮类化合物。但荔枝果肉对HepG2细胞的抗增殖活性与总多酚含量、总黄酮含量、ORAC和CAA值之间均呈现较弱的负相关性（p>0.05），提示某些特殊酚类单体或其协同作用在抗肿瘤细胞增殖过程中发挥主要作用。

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