刺五加提取物对人脐静脉内皮细胞紫外线辐射损伤的防护作用

张智，化洪苓，尹文哲，李晴，吕歌，刘洋，武天琦

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）（2.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150086）

在现代生活中，紫外线（UV）辐射与我们联系紧密，息息相关。紫外线照射会对人体皮肤造成严重伤害，如可影响真皮组织中的胶原及弹力纤维，产生皮肤光老化[1,2]；引起表皮层及真皮浅层的病变，产生日晒红斑、免疫抑制及皮肤癌[3～5]。目前国内外关注的焦点是开发天然的紫外线防护剂，主要研究的有黄酮类化合物、萜类化合物、鞣质类和香豆素类等[6]。张琛等[7]研究枸杞多糖对中波紫外线辐射的HaCat细胞具有氧化损伤的保护作用，可减轻细胞形态变化和脱片现象。辛蕾等[8]研究羟基花色素A对紫外线对皮肤成纤维细胞抗皮肤光老化具有一定的保护作用。郭砚等[9]研究臧雪莲多糖可以通过P38丝裂原激活蛋白激酶通路减轻中波紫外线对皮肤角质形成细胞的炎症损伤作用。崔砾砾等[10]研究苹果多酚对UVB辐射的HepG2细胞具有防护作用。喻晶等[11]研究紫外线照射对血管内皮细胞的损伤效应，显示在紫外线作用于皮肤细胞，组织实质产生变化之前，血管细胞会先出现异常反应[12]。由于HUVEC细胞对辐射具有强烈敏感性，因此选用HUVEC细胞进行抗紫外线辐射的研究。

刺五加是我国北方地区特产常用药材之一，素有“补中益精、强志意、久服轻身耐劳”等功效。其作为药物在古医书上已有记载，刺五加全身是宝，其根、茎和叶均可入药[13]，刺五加叶中含有丰富的黄酮类活性物质[14]。刺五加在小鼠抗辐射方面已有大量研究，莫琳芳[15]等研究了刺五加多糖对60Co γ射线辐照大鼠的胃肠道及生殖系统有保护作用。陈月[16]等研究了刺五加皂苷可减轻经 X射线照射的小鼠免疫功能的损伤，提高淋巴细胞转化率。本实验拟探讨四种刺五加提取物对经紫外线辐射的HUVEC细胞的预防和修复作用。

1 材料与方法

1.1 原料

未发酵刺五加水提物（Unfertilized Acanthopanax Extract，UAE）、未发酵刺五加醇提物（Unfertized Acanthopanax Alcohol Extract，UAA）、发酵刺五加水提物（Fermented Acanthopanax Extract，FAE）、发酵刺五加醇提物（Fermented Acanthopanax Alcohol Extracts，FAA）均由东北林业大学食品微生物实验室提供。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）由东北林业大学盐碱地实验室惠赠。

1.2 试剂

DMEM高糖培养基购自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶购自HyClone公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；双抗购自Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Biosharp公司；非必需氨基酸购自Biotopped公司、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和二甲基亚砜（DMSO）购自天津天力化学试剂有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒和DNA-Ladder细胞凋亡试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器设备

经济型医用离心机，北京鼎昊源科技有限公司；BCL-1000A型超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；GL-802A型微型台氧式真空泵，其林贝尔仪器制造有限公司；倒置显微镜，Olympus公司；酶标仪，基因有限公司；二氧化碳培养箱，SANYO公司；高速冷冻离心机，ThermoFisher公司；数显恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；722s可见分光光度计，中国上海精密科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及实验分组

HUVEC细胞用含10%的FBS、1%的双抗和1%的非必需氨基酸的DMEM高糖培养基，37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中培养[17]。0.25%胰蛋白酶消化传代，隔天换液，3天一传代。HUVEC细胞分为空白对照组，实验组（给药预防组，给药修复组）和辐射组。给药预防组于照射前12 h加入不同质量浓度的刺五加提取物进行孵化。

1.4.2 辐射模型的建立

取生长状态良好的HUVEC细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制得细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/孔，每孔200 μL加入96孔板中，空白对照组不加细胞悬液。24 h贴壁后吸出培养液，每孔加入磷酸盐缓冲液（PBS）200 μL，空白对照组用锡箔纸覆盖，实验组和辐射组接受紫外线辐射，每组设4个复孔，每组试验重复三次。紫外灯强度120 μw/cm2，分别照射1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，辐射后换液培养24 h后用MTT法[18]确定辐射剂量。

辐射剂量(mJ/cm2)=辐射强度(mw/cm2)×辐射时间(s)

1.4.3 MTT法测刺五加提取物对HUVEC细胞增殖的影响

将对数生长期的HUVEC细胞制成细胞悬液，以细胞浓度为5×104个/孔，每孔200 μL加入96孔板中，24 h贴壁后吸出上清液，再分别加入终浓度为50、100、200、400和800 μg/mL的刺五加提取物200 μL，空白对照组只加入200 μL的DMEM高糖培养基，每组设4个复孔，每组试验重复三次，于37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。24 h后各孔加入质量浓度5 mg/mL的MTT 50 μL，于37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中继续孵育4 h后弃上清，加入150 μL DMSO后振荡摇匀3～5 min，于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度值（OD）[19]。根据下式计算细胞存活率[20]。

1.4.4 刺五加提取物对HUVEC细胞紫外辐射损伤的预防作用

根据1.4.3，细胞做相同处理。先加入不同质量浓度的刺五加提取物预孵化12 h[21]后用1.4.2得到的辐射剂量辐射细胞。再培养12 h后进行MTT检测，每组设4个复孔，每组试验重复三次。

1.4.5 刺五加提取物对HUVEC细胞紫外辐射损伤的修复作用

根据1.4.3，细胞做相同处理。根据1.4.2得到的辐射剂量辐射细胞后加入不同终质量浓度的刺五加提取物细胞悬液培养24 h后进行MTT检测，每组设4个复孔，每组试验重复三次。

1.4.6 MDA和SOD的检测

根据1.4.3，细胞做相同处理后加胰酶消化，收集细胞，10000 r/min离心5 min，并用PBS液洗2次，放入高速冷冻离心机中，4 ℃，10000 r/min离心 20 min。离心后，取上清液据试剂盒说明测定各组 SOD的活性和MDA的含量[22～24]。

1.4.7 DNA-Ladder试验

1.5 数据分析

2 结果与讨论

2.1 不同辐射剂量对细胞形态学影响

HUVEC细胞于10%FBS、1%的双抗和1%的非必需氨基酸的DMEM高糖培养基中培养96 h后细胞形态见图1a，经紫外线辐射后形态变化如图b、c、d。

由图1可知，HUVEC细胞在96 h后基本达到对数生长期，在倒置显微镜下观察细胞为单层生长细胞，细胞贴壁生长，呈梭形，饱满，铺路石状生长。生长汇合后互不重叠，紧密镶嵌，随着紧密程度的提高，细胞体积还会稍微缩小[25]。经过紫外线辐射HUVEC细胞，细胞体积变小，胞膜气泡化，与邻近细胞分离，细胞间连接松散，空隙越来越大，细胞凋亡。

图1 HUVEC细胞形态Fig.1 The morphology of HUVEC cell

2.2 不同辐射剂量对细胞存活率的影响

图2 不同辐射剂量下的HUVEC细胞存活率Fig.2 Cell viability of HUVEC cells under different doses of radiation

按1.4.2建立辐射模型，紫外灯管距离HUVEC细胞垂直15 cm处照射细胞，时间分别为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min和6 min。经MTT染色测数，得到图2。

由图2可知，0～3 min内，HUVEC细胞在紫外线辐射下能促进其增殖，在第2 min中达到最高。第3 min后紫外线辐射开始抑制其增殖，随着时间的增加，辐射剂量的累积，细胞所承受的损伤越大，细胞存活率快速下降。应用SPSS 21.0分析得出在5.5 min时到达到半致死剂量，对应的辐射剂量为39.6 mJ/cm2。

2.3 刺五加提取物对HUVEC细胞增殖的影响

取生长状态良好的HUVEC细胞，制成细胞悬浮液，以每孔2 mL的量将细胞接种于6孔板上，每孔5×104个，试验按1.4.3和试剂盒说明进行。

图3 四种刺五加提取物不同质量浓度下HUVEC细胞存活率Fig.3 The cell viability of HUVEC cells at different concentrations of Acanthopanax senticosus extract

2.4 刺五加提取物对HUVEC细胞紫外辐射损伤的预防作用的结果

按1.4.4所示方法，经过处理的细胞先加入不同质量浓度的四种刺五加提取物孵育12 h后，用紫外线辐射5.5 min，继续培养12 h后，经MTT测数得到表2。

由表2可知，对照组细胞存活率为49.05%，四种刺五加提取物在低剂量50～200 μg/mL时，均无显著影响。

在中剂量200～400 μg/mL时，UAA，FAE有显著差异（p<0.05），FAA 有极显著差异（p<0.01）；在高剂量400～800 μg/mL时，除了UAE有显著差异外，其余均有极显著差异。在最高剂量800 μg/mL时，UAE仅仅到达56.64%的存活率与FAE在400 μg/mL时得细胞存活率相近。FAA在800 μg/mL时，细胞存活率达到65.67%，与对照组相比提高了33.88%，抗辐射预防效果显著。根据表2整体趋势，可看出发酵组比未发酵组抗辐射效果显著；醇提物比水提物抗辐射效果好。

表1 刺五加提取物对HUVEC细胞存活率的影响（±s，n=4）%Table 1 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the cell viability of HUVEC cells (¯x ± s, n = 4)%

表1 刺五加提取物对HUVEC细胞存活率的影响（±s，n=4）%Table 1 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the cell viability of HUVEC cells (¯x ± s, n = 4)%

刺五加提取物质量浓度/(μg/mL) UAE UAA FAE FAA对照组 100.00±2.55 100.00±2.55 100.00±2.55 100.00±2.55 50 101.61±2.57 99.73±1.50 101.13±2.20 101.02±1.68 100 100.81±2.42 99.19±1.68 100.00±1.60 101.29±1.60 200 98.12±0.36 98.06±0.42 99.19±1.68 98.66±0.84 400 97.02±0.82 96.83±1.33 97.72±0.92 97.96±0.54 800 96.72±0.87 96.72±0.95 97.37±1.51 97.07±1.13

表2 刺五加提取物对HUVEC细胞辐射损伤的预防作用Table 2 Preventive effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

2.5 刺五加提取物对HUVEC细胞紫外辐射损伤的修复作用的结果

按1.4.5所示方法，经过处理的细胞直接紫外线辐射5.5 min后再加入不同质量浓度的四种刺五加提取物孵育24 h，经MTT测数得到表3。

由表3可知，四种刺五加提取物在低剂量50～200 μg/mL时，均无明显的抗辐射修复作用。在中剂量200～400 μg/mL阶段，四种刺五加提取物均表现出极显著差异；在高剂量阶段400～800 μg/mL阶段细胞存活率仍在上升，只是逐渐缓慢，可见继续增加给药浓度对HUVEC细胞仍有修复作用，但必须在给药安全质量浓度范围内进行。

FAA在800 μg/mL时，细胞存活率为59.83%，仅为同一条件预防作用的91.11%。对比表2和表3，可以得出刺五加提取物在 HUVEC细胞抗紫外线辐射时，预防效果要优于修复效果。

表3 刺五加提取物对HUVEC细胞辐射损伤的修复作用Table 3 The recovery effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

2.6 刺五加提取物对HUVEC细胞中SOD和MDA的影响

根据2.4和2.5的结果选取对HUVEC细胞作用明显的高剂量组（400、600、800 μg/mL）来检测MDA的含量和SOD的活性。结果见表4～表7。

表4 药物预防组对HUVEC细胞中MDA含量（nmol/mL）的影响Table 4 Effects of drug prevention group on the MDA content (nmol/mL) in HUVEC cells

表5 药物修复组对HUVEC细胞中MDA含量（nmol/mL）的影响Table 5 Effects of drug repair group on the MDA content (nmol / mL) in HUVEC cells

由表4和表5可知，紫外线辐射使辐射对照组的MDA含量较空白对照组增加，但给药组均比辐射对照组降低，随着给药浓度的增加，HUVEC细胞中MDA含量也随之减少。

MDA间接反映了细胞受自由基攻击的程度，降低说明多余自由基已被清除，直接说明了刺五加提取物能有效预防和修复紫外线辐射对HUVEC细胞带来的损伤。

由表6和表7可知，辐射对照组与空白对照组相比，SOD活性显著降低。但给药组均比辐射对照组增加，随着给药浓度的增加，HUVEC细胞中MDA含量也随之递增。SOD间接反映了细胞清除自由基的能力，SOD活性的增强直接说明了刺五加提取物能有效预防和修复紫外线辐射对HUVEC细胞带来的损伤。

SOD是需氧生物体内的一种含金属离子的酶蛋白，其功能为催化超氧自由基的歧化反应，对机体起保护作用[16]。MDA是脂质过氧化过程中的代谢产物，其生成量间接反应过氧化氢对细胞的损伤程度，它可在膜内形成交联，使膜成分多聚化，进而导致膜结构和流动性改变，通透性上升[26]。SOD活性与MDA含量经常一起反应细胞内自由基的清除情况。经紫外线辐射，HUVEC细胞产生大量多余自由基，刺五加提取物可以降低细胞内MDA含量，增加SOD活性，减缓了细胞的凋亡，其结果与卢芳[22]和顾晓苏[27]一致。

表6 药物预防组对HUVEC细胞中SOD活力（U/mL）的影响Table 6 Effects of drug prevention group on the activity of SOD (U/mL) in HUVEC cells

表7 药物修复组对HUVEC细胞中SOD活力（U/mL）的影响Table 7 Effects of drug repair group on the activity of SOD (U/mL) in HUVEC cells

2.7 DNA-Ladder评价细胞DNA损伤

图4 刺五加提取物对HUVEC细胞辐射损伤的预防作用Fig.4 Preventive effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

图5 刺五加提取物对HUVEC细胞辐射损伤的修复作用Fig.5 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

按1.4.7进行DNA-Ladder检测细胞凋亡，运用凝胶成像系统拍照，结果如图4和图5。

紫外线辐射造成细胞凋亡的机制已有大量研究，其中主要热点为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路，紫外线可将其激活，是调节紫外线诱导多重细胞反应中的关键因素[28,29]。MAPK主要由四个家族组成，其中其中p38介导的炎症反应和凋亡在维护表皮完整性和对抗紫外线诱导的肿瘤效应方面具有重要作用[30]。刺五加提取物含有大量的黄酮类成分，是天然的强抗氧化剂。猜想加入干预后可抑制p38MAPK途径活化和炎症因子分泌，进而减轻紫外线辐射造成的细胞凋亡。

图4为药物预防组的DNA条带，从左至右分别为 DNA Marker：DL2000、空白对照组、800 μg/mL、600 μg/mL、400 μg/mL组、辐射组。由图4可知，经紫外线辐射后，不同的给药浓度处理后均产生典型的DNA条带。空白对照组（未经紫外线辐射）与辐射组比较，未产生DNA-Ladder明显条带，说明空白对照组 DNA含量多且完整；辐射组则有明显的DNA-Ladder凋亡条带。给药组三个浓度均比辐射组条带有所改善。随着给药浓度的增加，DNA凋亡减少。同理图5为药物修复组的DNA条带，组内趋势与给药预防组相同。对试验结果分析，可见刺五加提取物可有效的预防和修复经紫外线辐射对HUVEC细胞的损伤，且与给药浓度呈剂量依赖性关系。

紫外线现已成为主要的辐射伤害源，紫外线引起的皮肤光老化的主要机制有：氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、胶原和弹性蛋白的降解等。由于紫外线损伤是皮肤健康的主要危险因素，也是皮肤衰老过程的主要原因，保护人体皮肤免受紫外线损伤具有重要价值[31]。刺五加提取物中含有大量的皂苷类成分，主要包括紫丁香苷，金丝桃苷和齐墩果酸等，此外还含有丰富的黄酮类活性成分，均具有优良的抗氧化抗衰老作用。为解释刺五加提取物抗辐射作用提供一定的理论支持。

3 结论

人脐静脉内皮细胞是重要的辐射敏感细胞，用其构建紫外线辐射模型可有效的解释和说明刺五加提取物抗紫外线辐射的能力。经试验HUVEC细胞半致死紫外线辐射剂量为39.6 mJ/cm2，质量浓度≤800 μg/mL均为安全浓度，在其范围内不会因为刺五加自身引起HUVEC细胞的凋亡。刺五加提取物可有效预防和修复经紫外线辐射后的HUVEC细胞，减少其凋亡数量，DNA-Ladder试验出现明显的凋亡条带。FAA在给药预防组浓度800 μg/mL时，可提高细胞存活率33.88%，预防组效果均优于修复组。通过SOD水平和MDA含量可协同反映出刺五加提取物含有有效的天然抗氧化成分，为开发天然抗氧化剂提供一定参考依据。

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