小球藻培养的初步研究

耿晓玲

(江阴职业技术学院 化学纺织工程系， 江苏 江阴 214433)

小球藻为绿藻门小球藻属单细胞绿藻,含有丰富的蛋白质、多糖、脂类、微量元素和一些生物活性代谢产物[1-3],不仅广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精细化工品和医药制剂原料，在污水处理,水产养殖饵料以及畜牧饲料添加剂的生产等方面也被广泛应用[4-5]。小球藻的培养方式主要有开放式培养和封闭式培养。开放式培养由于受到自然条件如阳光、温度等的影响和限制, 产量不稳定，易受到他种生物的污染甚至取食,引起培养藻液的退化。封闭式培养相对而言便于控制、能抗污染、可提高产率，整个系统稳定性好[6]。本文研究了封闭式培养条件下小球藻的生长，探讨光照方式、光强以及培养基中的营养元素对小球藻生长的影响，为提高小球藻的产量，增加藻粉的收率提供依据。

1 实验仪器及试剂

1.1 菌种及培养基

菌种:小球藻Chlorella zofingensis属于绿藻门，直径3～10微米，由中国科学院提供。培养基:BG-11。培养基BG-11主要成分见表1。

表1 培养基BG-11主要成分一览表

A5按以下物质称量并定容至1000mL。A5成分见表2。

表2 A5成分明细表

1.2 主要仪器

主要仪器见表3。

表3 主要仪器一览表

2 菌种的培养方法

2.1 菌种的分离纯化

将BG-11琼脂培养基放入水浴中加热至融化，倒平板制得平板，将整个培养皿皿底划分为1，2，3，4四个面积不等的部分，待用。挑取菌种，按照无菌操作流程进行划线培养。

2.2 小球藻生长的通气培养装置

通气培养装置主要由长方体水槽，光源系统，控温系统，水循环系统，空气供给系统和CO2供给系统组成。容器为平板玻璃制成的长方体水槽，水槽底部设有有机玻璃支架；光源系统为4根日光灯直射；控温系统由恒温水浴、输水管和热交换器组成，控温范围0～50℃，控温精度0.1℃；水槽内水循环系统是由通气沙头组成，保持各部分水温一致。空气供给系统由小型空气泵、输气管、流量调节阀门和沙头组成，供气压强0.04MPa，每个培养管的气流大小都可单独调节，获得所需的气流。pH值控制8～9的范围内。

2.3 菌种的扩大培养

将平板上的菌种接到2L锥形瓶中，使用无菌培养液进行培养，在室温24°C的环境中进行培育，培养至对数周期,接种至10L培养瓶中，继续进行扩大培养，培养至对数周期。取藻液，4000r /min 离心8min，收集藻细胞，无菌水清洗两次，再将离心收集的藻种分别接种于培养基中，调节初始OD550为0.5± 0.005，经处理的藻液分装入玻璃容器中，每个玻璃缸为35L，置于通气培养装置中，进行通气培养。

2.4 细胞干重的测定

将0.45μm滤膜放入烘箱中于65℃烘至恒重，编号，称重，每组做3个平行，取平均值。已烘干至恒重的滤膜放入针头滤器中，精确吸取5ml藻液于注射器内，并注入到针头过滤器中过滤，用蒸馏水冲洗2～3次，藻体连同滤膜放入65℃烘箱中烘至恒重，再称重。

2.5 生长速率测定

采用BG-11 培养基，在200μmol m-2s-1，( 30 ± 1) ℃条件下通气培养小球藻，接种后1～3d，藻液OD 值快速增长，第4天，增长速率明显减缓，4d 以后，OD 值变化不明显。所以，用培养前4d 的平均生长速率表示各种培养条件下小球藻的比生长速率μ(d-1)。

式中，OD1和OD2分别是刚接种和培养4d 的藻液OD 值，t1和t2是对应的培养时间( d) ，t2-t1= 4(d)。

2.2.6 氮浓度对小球藻生长的影响

以硝酸钠调节氮浓度，加入硝酸钠的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L,其他各组分保持一致，实验中的光源为日光灯照射，温度控制在24℃左右,其他培养条件同上，培养4d后，测定生长速率。

2.2.7 Fe3+浓度对小球藻生长的影响

分别向5组玻璃缸( 每组3个平行样) 补加FeCl3·6H2O 与EDTA-2Na 等物质的量混合液，补加的Fe3+的浓度依次为0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培养4d后，测定生长速率。

2.2.8 不同磷浓度对小球藻生长的影响

分别向5组玻璃缸补加K2HPO4溶液，浓度依次为10，20，30，40，50mg /L，培养4d后，测定生长速率。

2.2.9 不同盐度培养条件下小球藻的生长速率

调节培养基NaCl浓度依次为0，0.1，0.3，0.5，0.7mol /L，培养4d后，测定生长速率。

2.2.10 光照对小球藻生长的影响

采用不同的光照方式，小球藻分3批进行培养，分别为全光照，间隔光照，黑暗条件下进行培养11天，11天后对3批小球藻进行干重测定，期间3批小球藻的培养基，pH值，温度相同。将室内培养的10L 瓶中的小球藻转到室外，在全光照条件下调节光照强度，分别为1000，3000，5000，7000lux,培养11天，接种时密度控制在OD550为0.5± 0.005，培养方式为人工通气。反应器：“S”型反应器，容量3500L。环境因素的测量方式为连续测量11天的光强，如遇到阴天，雨天正常进行测量。生长数据的测量为每天下午2点进行补水，2∶30进行取样测干重。

3.1 结果分析

3.1.1 不同氮浓度培养条件下的小球藻的生长速率

小球藻生长速率随着培养基氮源浓度加大而提高，5组不同氮源浓度培养条件下，氮源浓度为0.1g/L时，其生长速率与其他4组差异极显著，当氮源浓度为0.2g /L 时，生长速率与其他4组差异极显著，氮源浓度为0.3g /L与0.4g /L 两组间生长速率没有显著差异,0.4g/L小球藻的生长速率开始下降。不同氮浓度对生长速率的影响见图1。

图1 不同氮浓度对生长速率的影响

氮是微藻生长必需的大量元素之一，对于藻类的生长、繁殖等生理活动有着重要的作用，不同的藻种对氮源的要求有差异，氮源的种类、浓度发生变化，会影响微藻的生理生化特性，如微藻的生长状况，类胡萝卜素的积累，胞外多糖的产生，脂肪酸含量以及酶活性等。实验表明氮浓度对小球藻的生长速率有着显著的影响，随着氮浓度的增加，生长速率提高了,0.4g/L小球藻的生长速率开始下降。

3.1.2 不同铁浓度培养条件下小球藻的生长速率

铁浓度的变化没有对小球藻的生长产生明显的影响。统计分析表明，不同浓度Fe3+( 10～160mg /L) 培养小球藻，生长速率没有显著差异。不同铁浓度对小球藻生长速率的影响见图2。

图2 不同铁浓度对小球藻生长速率的影响

铁元素是植物生长所必需的微量元素，但在实验中表明Fe3+对生长速率的影响不大。

3.1.3 不同磷浓度培养条件下小球藻生长速率

磷浓度的变化没有对小球藻的生长产生明显的影响。统计分析表明，不同浓度K2HPO4( 10～50mg /L) 培养小球藻，生长速率没有显著差异。不同磷浓度对小球藻生长速率的影响见图3。

图3 不同磷浓度对小球藻生长速率的影响

磷浓度增加至30～40mg/L 时小球藻的生长速度最快但不明显表明。说明小球藻对磷浓度变化的适应能力很强，磷浓度的变化不会影响其生长。

3.1.4 不同盐度培养条件下小球藻的生长速率

NaCl 浓度不高于0.4mol /L 时，小球藻生长速率随盐浓度的增加而增加，NaCl 浓度0.4mol /L 之后生长速率开始下降。不同盐度对小球藻生长速率的影响见图4。

有关盐度对小球藻生长、光合速率、叶绿素含量的研究已有一些报道，一般来讲小球藻对盐度有较强的适应性，但盐度过高时藻体开始出现发白、沉底现象，以后藻体陆续死亡。

本研究中，在盐度不高于0.4mol /L 的范围内，盐度增高对小球藻生长影响不显著，当盐度达到0.5mol时，生长速率开始降低，盐度为0. 4mol /L 时，小球藻的生长速率达到最高。

3.1.5 光照对小球藻生长的影响

光照方式对小球藻生长的影响见表4，表5光照强度对小球藻生长的影响。

表4 光照方式对小球藻生长的影响

表5 光照强度对小球藻生长的影响

最后获得小球藻干重分别为0.985g，0.761g，0.243g。由此可见，小球藻在全光照条件下能够正常的生长，间隔光照条件下小球藻的生长受到了一定的影响，在黑暗条件下小球藻生长的极其缓慢。在全光照条件下，光照强度也影响着小球藻的生长，在3000～5000lux之间，小球藻的生长情况良好，光照强度过低或过高不利于小球藻的生长。

随着小球藻应用领域的不断拓展，其发展前景将更加广阔。而小球藻的大量生产影响着小球藻的研究与发展。本文从培养基的营养成分分,光强别加以讨论分析，得出以下结论：在小球藻的培养过程中，氮浓度对小球藻的生长速率有着显著的影响，随着氮浓度的增加，生长速率提高到0.4g/L时，小球藻的生长速率达到最佳。Fe3+对小球藻的影响不大。小球藻对磷浓度变化的适应能力很强，30～40mg/L 时小球藻的生长速度最快，但不明显。总体来说铁元素与磷元素在此实验中对小球藻的生长速率没有显著的影响。在盐度不高于0.4mol /L 的范围内，盐度增高对小球藻生长影响不显著，当盐度达到0.5mol时，生长速率开始低，盐度为0.4mol /L 时，小球藻的生长速率达到最高。

在光照对比实验中发现全光照有利于小球藻的生长，而在黑暗条件中小球藻生长缓慢。在全光照条件下,小球藻在3000～5000lux之间生长情况良好，光照强度过低或更高不利于小球藻的生长。

[1] 李师翁,李虎乾.小球藻干粉的营养学与毒理学研究[J].食品科学,1997,18(7):48- 51.

[2] 黄冠华,陈 峰,任庆功.应用小球藻制备生物柴油[J].太阳能学报,2010，31(9):1085-1091.

[3] 胡月薇,邱承光.小球藻处理废水研究进展[J].环境科学与技术,2003,26(4):48-49.

[4] Chen Ying, Wang Yiqin,Sun Yongru,et al.Highly efficient expression of rabbit neutrophil peptide-1 gene in chlorella ellip so idea cells[J].Curr Genet,2001,39:365-370.

[5] 王业勤,李勤生.小球藻应用研究动态[J].微生物学通报,1985,12(6):275-277.

[6] 李师翁,李虎乾,张建军.小球藻大规模培养研究的进展[J].植物学报,1998,15(4):14-18.

(本文文献格式：耿晓玲.小球藻培养的初步研究[J].山东化工，2018，47(02)：35-37,39.)