食管鳞癌细胞系EC109射线照射后miRNAs和DNA-PKcs的变化及相关性分析

庞艳华， 马 军， 赵晓静， 李雨濛， 李 南， 孙 佳， 袁 翎

1.北京朝阳医院消化内科，北京 100043； 2.郑州大学第二附属医院检验科 郑州大学消化疾病研究所； 3.郑州大学第二附属医院肿瘤科； 4.郑州大学附属肿瘤医院 河南省肿瘤医院放疗科

食管癌死亡率位于所有肿瘤的第6位，5年生存率<20%[1]。放疗是进展期食管癌主要的治疗方法，通过产生自由基使DNA双键断裂(DSB)，诱导细胞损伤，如果靶细胞不能修复这种类型的损伤，可以直接或间接地导致细胞死亡[2]，而肿瘤细胞在DNA损伤后，常常启动修复机制，导致治疗失败。DNA双键断裂有两条主要的修复通路：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HRR)，DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)是非同源末端连接的中心因子[3]，在DNA断裂修复中起着重要作用。

miRNA作为一种内源性小单链非编码RNA，能通过降解靶基因mRNA或抑制靶基因转录后翻译进而调控靶基因的表达，其参与许多生理性和病理性的进程，包括放射损伤相关的信号传导通路[4-5]。本文利用食管鳞癌细胞系EC109，检测放射照射后miR-101、miR-21、miR-126的变化，并分析它们和DNA-PKcs的关系，了解食管鳞癌放射照射后miRNA表达是否和调控DNA修复有关。

1 材料与方法

1.1试剂和细胞食管鳞癌细胞系EC109由郑州大学消化疾病研究所提供，培养于质量浓度为100 g/L的新生牛血清(Thermo产品)、青链霉素(各100 U/ml)的RPMI 1640培养基中(BI产品)，培养条件37 ℃，体积分数为5%的CO2。

1.2X线照射待细胞生长至对数期时，用X射线对细胞进行照射，根据照射剂量分为五组(0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy)。X射线采用瑞典医科达公司直线加速器，型号：Synergy，速率2 Gy/min。照射后继续培养24 h后，收集细胞，提取细胞中的RNA或用蛋白裂解液提取蛋白。

1.3细胞中总RNA的提取用Trizol(Invitrogen)提取细胞中的RNA。按照说明书，1×106细胞用1 ml Trizol裂解后，加入200 μl氯仿；震荡15 s后，静置3 min；12 000×g离心10 min，取上层透明水相；加入500 μl异丙醇，震荡后静置10 min；12 000×g离心10 min；弃上清，用质量浓度为750 g/L的乙醇洗涤RNA沉淀1次；弃掉乙醇后，置于通风橱干燥30 min；加入50 μl超纯水溶解RNA。RNA处理过程中需注意RNase污染，所用试剂均用无RNase水配置，耗材为无RNase产品。RNA样品溶解后用质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳观察完整性；用NanoDrop 2000测定浓度。miRNAs引物由GenePharma公司合成提供，mRNA检测引物由上海生工合成(见表1)。

表1 本实验所用引物

1.4RNA的逆转录逆转录反应，根据Thermo Scientific(DNA-PKcs)和GenePharma(miR-126/miR-101/miR-21)试剂盒说明书进行，所有操作均在冰上进行。DNA-PKcs的cDNA反应体系为20 μl，含5×RT缓冲液4 μl、10 mmol/L dNTPs 2 μl、200 U/μl M-MuLV逆转录酶0.2 μl、20 U/μl RNA酶抑制剂1 μl、0.2 μg/μl逆转录随机引物1 μl、总RNA 1 μg、无RNase水补足至20 μl；反应条件：25 ℃ 5 min，37 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。

miRNA的cDNA反转录体系为：1 μmol/L引物1.2 μl、RNA 1 μg、5×RT缓冲液4 μl、10 mmol/L dNTP 0.75 μl、MMLV逆转录酶0.2 μl、无RNase水补足至20 μl。反应条件：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.5荧光定量PCR反应反应体系为20 μl，包括2×qPCR Master Mix(SYBR) 10 μl、引物(10 μmol/L)0.4 μl、Taq DNA多聚酶(5 U/μl)0.2 μl、Template cDNA 3 μl，双蒸水补足至20 μl，ABI PRISM 7500 PCR仪器对cDNA进行扩增，并绘制熔解曲线。miRNA反应条件设置为：95 ℃ 3 min 1个循环，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s 40个循环。DNA-PKcs反应条件设置为：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环。用熔解曲线检测引物的特异性。miRNA的表达水平用内参U6snRNA标准化，DNA-PKcs表达水平用内参β-actin标准化，2-△△Ct法计算表达量。

1.6免疫印迹(Westernblotting) 细胞收集后，用蛋白裂解液提取细胞中的蛋白，质量浓度为100 g/L的分离胶电泳，转膜2 h×250 mA(DNA PKcs转膜12 h)。质量浓度为50 g/L的BSA室温封闭1 h。兔抗人DNA PKcs为1∶3 000，β-actin为1∶4 000，4 ℃孵育过夜。TBST然后洗膜3次后，二抗孵育60 min。洗膜3次后ECL染色，用FluorChem FC3成像仪采集和灰度分析，β-actin作为内参，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1食管鳞癌细胞系EC109放射照射后miR-126、miR-21、miR-101和DNA-PKcsmRNA及蛋白的表达情况经过单因素方差分析，食管鳞癌细胞系EC109放射照射24 h后，miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.05)；miR-21有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05,见图1)。食管鳞癌细胞系EC109放射照射24 h后，随着照射剂量增加，DNA-PKcs蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

注：图1中miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs定量PCR结果采用ANOVA分析，F值分别是9.346、13.204、0.844、43.231；图2采用ANOVA分析，F=0.6414，P=0.6451。

图1食管鳞癌细胞系EC109放射照射后miRNAs及DNA-PKcsmRNA的表达；图2食管鳞癌细胞系EC109放射照射后DNA-PKcs蛋白表达

Fig1ExpressionsofmiRNAsandDNA-PKcsmRNAinesophagealsquamouscellcarcinomacelllineEC109afterradiation;Fig2ExpressionofDNA-PKcsproteininesophagealsquamouscellcarcinomacelllineEC109afterradiation

2.2食管鳞癌细胞系EC109放射照射后miR-126、miR-21和miR-101水平与DNA-PKcsmRNA水平的相关性分析采用Spearman相关分析，食管鳞癌细胞系EC109放射照射后miR-126、miR-101、miR-21表达水平与DNA-PKcs mRNA表达无明显相关性(P>0.05)。而miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关，相关系数为-0.885(P=0.008)。

3 讨论

3.1放射照射后DNA-PKcsmRNA表达升高DNA-PKcs是DNA-PK的催化亚基，在非同源末端连接(NHEJ)中发挥重要作用，其可以介导DNA双键断裂的修复[6]。食管癌的放疗抵抗性是导致治疗失败的主要原因，放疗抵抗性主要的机制之一是PI3K/Akt信号通路的过度激活，AKT通过刺激DNA-PKcs有助于DNA双键断裂的修复。因此，抑制DNA-PKcs可以导致DSB修复失败，进而增加电离辐射诱导的细胞毒性[7-8]。TOULANY等[9]研究发现，双重抑制PI3K和MEK可以增强A549和H460的放疗敏感性。因此，研究其放疗抵抗性机制、寻找放射增敏剂是提高食管鳞癌疗效的途径之一。

DE ANDRADE等[10]发现，与对照组相比，照射后(4 Gy、6 Gy)胶质瘤细胞株中DNA-PKcs的表达升高。与在正常的肝细胞中相比，肝癌细胞株HepG2中的DNA-PKcs蛋白表达升高[11]；60 Gy电离辐射进一步增强DNA-PKcs表达，说明DNA-PKcs在电离辐射的DNA修复中起着关键的作用。本研究发现，不同剂量X-Ray照射后食管鳞癌细胞系EC109后24 h，DNA-PKcs mRNA表达升高，且差异有统计学意义。尽管DNA-PKcs蛋白表达的分析显示，差异无统计学意义，但其蛋白表达有升高趋势。可能与照射剂量、收集细胞的时间点有一定关系，因为照射处理后，mRNA的表达变化最先发生，然后通过增强蛋白的翻译，表现为蛋白表达升高。

3.2放射照射后miRNAs的变化miRNAs是一类内源性非编码的小RNAs，在转录后发挥作用，参与调节细胞生命进程，包括细胞生长、分化、增殖、凋亡等过程[12]。miRNAs和肿瘤的发生、发展关系密切，也有可能参与调节肿瘤细胞的放射敏感性[13]。因此，筛选DNA-PKcs相关的miRNAs，有助于揭示miRNAs调节DNA修复的机制，从而发现与肿瘤细胞的放疗敏感性相关的miRNAs，并找到提高其放疗敏感性的新靶点。目前关于miRNAs与食管癌放疗敏感性及其与DNA-PKcs关系的研究少见报道。

我们选择了与食管鳞癌相关的3种miRNAs。miR-21作为原癌基因和肿瘤发生相关[14]。MA等[15]报道，下调miR-21可以通过抑制PI3K/Akt信号通路来增强非小细胞肺癌细胞株A549的放疗敏感性。本研究用2～8 Gy照射EC109后，尽管没有发现miR-21表达差异有统计学意义，但有下降趋势，且miR-21的水平与DNA-PKcs mRNA呈负相关，提示miR-21可能对DNA-PKcs mRNA表达有调节作用。SASAKI等[16]研究发现，辐射后(30 Gy)胶质瘤细胞株中miR-21的表达升高，但60 Gy辐射后胶质瘤细胞株中miR-21的表达消失。因此，进一步探讨高剂量放射照射，将会进一步揭示miR-21的变化。

miR-126在人食管鳞癌组织中低表达，且通过调节PI3K/AKT信号通路抑制EC109细胞的增殖和迁移[17]。miR-126可以调节PI3K信号通路，影响磷酸化的AKT表达进而抑制肿瘤生长[18]；放射治疗后患者的外周血中miR-126表达升高，提示其可以作为放疗敏感性的一个标志物[19-20]。miR-101在食管鳞癌组织和多种细胞系中低表达[21]，转染miR-101的肺癌细胞株对电离辐射更加敏感；miR-101可通过靶向调节DNA-PKcs和ATM来增强肺癌细胞株的放疗敏感性[22]。本研究发现，不同剂量X-Ray照射后食管鳞癌细胞系EC109中miR-126和miR-101表达升高，但未发现miR-101、miR-126与DNA-PKcs之间有相关性，与肺癌中miR-101靶向DNA-PKcs的研究结果不一致[22]，可能与肿瘤类型差异有关。

本研究发现，食管鳞癌细胞系EC109中X-Ray照射后miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表达上调，而miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关，这些变化提示，放射损伤导致的DNA修复过程中，miRNA可能发挥着调控作用。

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