昼夜变化对广藿香中挥发油及其主要成分积累的影响

刘 璐， 吴友根， 张军锋， 于 靖

(海南大学园艺园林学院，海南海口 570228)

广藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，原产于菲律宾、马来西亚等国，梁代或之前传入我国[1]，现主要分布于海南和广东2省，广东肇庆、广州、湛江以及海南万宁等地均有栽培，同时福建、广西和台湾等地也有少量种植。广藿香以其干燥地上部分入药，是我国常用的芳香化湿类中药，其味辛，性微温，归脾、胃、肺，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑之功效。主要用于湿浊中阻、暑湿倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛腹泻、鼻渊头痛的治疗[2]，现已是藿香正气水(片、丸、口服液)、抗病毒口服液等30多种中成药的主要原料[1]。此外，在2003年防治非典型性肺炎期间，以广藿香为主要药效成分的藿香正气水、藿香正气软胶囊等系列产品在全国各地畅销，对预防非典具有良好的效果，为广藿香新产品的开发创造了良好的市场契机，发展前景非常广阔。除药用外，广藿香还是重要的芳香植物，从该植物中提取的广藿香油在日用品及化工行业中得到广泛应用，可用作化妆品、定香剂、杀虫剂等的生产配料[3]。

广藿香油被认为是广藿香的主要药用成分[4-5]，一直是人们研究的焦点。20世纪70年代，学者首次从广藿香油中分离得到具有抗真菌生物活性的广藿香酮[6]。近年来，随着气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的普及，广藿香挥发性成分的分析变得快捷简便，出现了较多的分析报道。

研究表明，倍半萜合酶基因的表达受生物钟调节，通常以日为周期，基因的表达量和产物呈午后高而夜间低的变化规律，分析成熟广藿香在1 d内不同时间点挥发油及其主要成分含量的变化，对于确定广藿香药材的最佳采收时间具有十分重要的意义[7]。为此，本试验采用GC-MS技术分析成熟广藿香在昼夜变化过程中挥发油及其主要成分的含量变化，以期为广藿香挥发油及其主要成分的积累机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本试验所用成熟广藿香材料，均取自海南大学园艺园林学院广藿香资源圃。

为探讨广藿香中百秋李醇等的含量是否受昼夜变化的影响，在广藿香成熟期某天24 h内的8个时间点(09：00、12：00、15：00、18：00、21：00、00：00、03：00和06：00，每隔3 h采样1次)采集各成熟广藿香地上部分，并进行低温干燥处理，用于提取广藿香油，分析其中百秋李醇等的含量差异。

所用仪器为HP6890/597型气相色谱/质谱联用仪(美国)。

1.2 试验方法

1.2.1 挥发油提取 将广藿香地上部分材料阴干后用打粉机磨碎，采用水蒸气蒸馏法[8]提取挥发油。称取100 g粉末，加7倍体积的水浸泡5 h，提取4 h后用无水硫酸钠干燥，于 0 ℃密封避光保存，备用。

1.2.2 GC-MS分析条件 气相色谱条件：色谱柱为HP-Intiowax Polyethylene Glycol弹性石英毛细管柱(柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚度0.25 μm)，柱温50 ℃，以6 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min，汽化室温度为250 ℃。载气为髙纯氦气(99.999%)，柱前压52.5 kPa，载气流量1.0 mL/min。进样量1.0 μL，分流比20 ∶1。

质谱条件：电子轰击式离子源(electron impact ion source，简称EI)，温度230 ℃；四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，倍增器电压837 V，接口温度250 ℃，质量范围10～500 u。

化合物鉴定及数据处理：采用色谱峰面积归一化法计算化合物的相对含量[9]，结合WILEY275质谱图库和NIST2005标准质谱图库，通过HPMSD化学工作站进行化合物鉴定。方差分析采用SAS软件，在0.05水平下分析不同样品间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 昼夜变化对挥发油含量的影响

从图1可以看出，1 d内的8个时间点广藿香油含量变化较大，变化范围为0.69%～1.01%，平均含量为0.83%。广藿香挥发油的含量从00：00的0.81%上升至03：00的 0.88%，增长幅度为8.6%。06：00时含量下降到1 d中的最低值，为0.69%，09：00—12：00挥发油含量小幅上升至 0.82%，较06：00的增幅为18.8%。到15：00时广藿香油含量上升至最高值，为1.01%，18：00时挥发油含量下降为 0.80%，较15：00时降幅为20.8%。采收时间在18：00—00：00 时挥发油含量趋于稳定。

2.2 昼夜变化对百秋李醇含量的影响

由图2可知，在昼夜变化过程中，广藿香油中的百秋李醇含量变化较大，其变化范围为28.43%～34.08%，平均含量为31.36%。在00：00时百秋李醇的含量达到最低值，03：00含量上升至33.49%，增幅17.8%。03：00—06：00百秋李醇的含量呈下降趋势，09：00—12：00百秋李醇的含量上升，12：00 时含量达到最高值，为34.08%，12：00—15：00含量由34.08%下降至29.79%，而15：00—21：00百秋李醇含量逐渐上升。

2.3 昼夜变化对其他挥发油成分含量的影响

广藿香油成分在1 d内不同采收时间的含量变化见表1，可以看出，昼夜变化过程中，广藿香油中β-广藿香烯(β-patchoulene)、β-榄香烯(β-elemene)、石竹烯(caryophyllene)、α-愈创木烯(α-guaiene)、刺蕊草烯(seyehellene)、葎草烯(humulene)、α-布藜烯(α-bulnesene)和法呢醇(farnesol)等主要成分的含量变化表现出不同趋势。

从图3-a中可以看出，β-广藿香烯和法呢醇含量在昼夜变化过程中大体上具有相反的积累趋势。β-广藿香烯含量的变动范围为1.16%～3.24%，平均含量为2.50%；法呢醇的含量变化幅度较大，变化范围为1.42%～7.65%，平均含量为 3.83%。在09：00时，法呢醇的含量达到最高值，为7.65%；β-广藿香烯的含量则降为1 d中的最低值，为 1.16%。09：00—18：00，法呢醇含量先骤降到1.79%，然后上升至 15：00 的5.63%，之后再下降，然而β-广藿香烯的含量表现出完全相反的变化趋势。21：00时法呢醇和β-广藿香烯含量均有所下降，且法呢醇含量降至最低值1.42%。21：00—06：00之间，β-广藿香烯的含量先逐渐上升，至 03：00 时达到最高值，为3.24%，然后含量逐步下降；而法呢醇含量则是先急剧上升，在00：00时达到相对较高值，接着至06：00呈下降趋势。

表1 昼夜变化对广藿香油成分的影响

注：同类数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

挥发油中β-榄香烯、石竹烯、葎草烯3种化学成分的含量在1 d中呈现相似的变化趋势(图3-b)，平均含量分别为0.75%、2.38%、0.96%。在06：00时，这3种化学成分均达到含量最高值，分别为0.85%、2.75%、1.08%；21：00时，β-榄香烯的含量同样为最高值0.85%。采样时间从09：00—18：00，β-榄香烯、石竹烯的含量呈波动性变化，18：00 时达到最低值，分别为0.57%、1.60%；葎草烯含量的变化趋势与上述2种物质相似，区别在于在18：00时其含量有小幅上升而不是下降。18：00—06：00，β-榄香烯、石竹烯、葎草烯的含量均先上升再小幅下降，然后上升至最高值。

在1 d中不同时间点采收的广藿香，α-愈创木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯的含量具有几乎相同的动态变化趋势(图3-c)，平均含量分别为6.73%、4.68%、9.54%。α-愈创木烯、刺蕊草烯和α-布藜烯的含量均在18：00时达到最高值，分别为7.77%、5.58%和10.74%。18：00—00：00，3种成分含量均呈下降趋势，且α-布藜烯含量在00：00时降至最低值，为8.72%。与00：00相比，03：00时3种成分的含量均有所上升，然后03：00—06：00含量逐渐下降，α-愈创木烯、刺蕊草烯含量在09：00时达到最低值，分别为 5.34%、3.61%。09：00—18：00，3种成分的含量呈波动性变化，并均于18：00时达到最高值。

3 讨论与结论

植物次生代谢产物的生成由遗传因素控制，但同时也受到各种环境因素(光照、温度、土壤、灌溉、营养物质及季节和采收时间等)的影响[10-14]。挥发油的含量及其成分是芳香植物最重要的质量标准之一。研究表明，昼夜变化对绿薄荷(MenthaspicataL.)[15]、蔷薇(RosadamascenaMill.)[16]、薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)[17]、芫荽(CoriandrumsativumL.)[18]等作物的挥发油产量和成分具有重要的影响，这些结果可能与光照、温度和相对湿度等气候条件的昼夜变化有关系。

广藿香油被认为是广藿香的主要药用成分，同时也是香料工业中的一种重要的天然香料，其形成与积累受到多种因素(品种与产地[19]、植株部位与生长期[20]、施肥[21]、栽培方式[22]等)的影响。广藿香油含量是评价广藿香药材品质的一个重要指标，关于广藿香油含量随植株生长和采收期的变化已有许多研究报道[20，23]，然而昼夜变化对广藿香油含量的影响却鲜见报道。分析成熟广藿香在1 d内不同时间点挥发油含量的变化，对于确定广藿香药材的最佳采收时间具有十分重要的意义。本研究以海南广藿香为试验材料，24 h内每隔3 h采样1次，结果表明，昼夜变化过程中广藿香油的含量在15：00时达到最高值，06：00时含量最低，其余时间含量较稳定。1 d中气温随时间的连续变化称为气温的日变化，通常在14：00—15：00达到最高值，06：00左右(日出前后)最低。这些结果表明，较高的温度可能更有利于广藿香中挥发油的生成与积累。

百秋李醇是历版《中华人民共和国药典》规定的用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分，其含量受到栽培条件、生长环境、采集部位和生长期等因素的影响。学者将广东广州、高要、雷州、吴川、遂溪及海南万宁等6个产地的广藿香分为2个化学型：挥发油含量最高成分为百秋李醇的“琼香类”，称为广藿香醇型；挥发油含量最高成分为广藿香酮的“牌香类”，称为广藿香酮型[24]。研究分析这6个产地广藿香油中百秋李醇在不同采收时期的含量变化发现，产地与采收时期均对百秋李醇的含量有较大影响，广东雷州、遂溪和吴川产广藿香在10月采收时其挥发油中的百秋李醇含量最高，海南万宁以7月份采收时含量最高，而广东高要则以11月份采收时含量最高。陈英采用GC-MS技术探讨广藿香生长发育与百秋李醇含量积累的关系，结果表明，海南广藿香油中百秋李醇的含量从植株生长的第135天到第210天呈上升趋势，且在第210天时达到最大值[20]。不同生长环境、部位、采收期广藿香中的百秋李醇含量都存在明显差异，严重影响广藿香药材的稳定性及临床疗效，因而有必要对广藿香中的百秋李醇形成与积累机制进行研究。

百秋李醇对广藿香油的质量控制具有重要意义，百秋李醇的含量不低于30%是目前市场上对广藿香油的最低标准[25]，因此，植株1 d内不同时间点的百秋李醇含量可以作为确定广藿香最佳采收时间的重要指标。本研究结果表明，百秋李醇的含量在12：00时达到最高值，12：00—21：00其含量呈先急剧下降后缓慢上升的变化趋势，在00：00时含量下降至最低值，00：00—06：00百秋李醇含量呈先急剧上升后逐渐下降的变化趋势。Zlatev报道，香芹酮在莳萝油中的积累同样在12：00时达到最大值[26]。

研究发现，广藿香油成分随产地、生长期、植株部位的不同而有所差异。在广东吴川、万宁、遂溪及雷州等地的广藿香油中，百秋李醇为含量最高的成分，而广东高要和广州等地产的广藿香挥发油成分则与其他产地明显不同，广藿香酮为其含量最高的成分[24，27]。在海南广藿香根、茎和叶挥发油中，百秋李醇为含量最高的成分，百秋李醇、α-愈创木烯等倍半萜类化合物的含量均在植株生长至第210天时达最高值[28]。本研究通过对昼夜变化过程中广藿香油成分含量的差异进行分析发现，各成分的含量均受到采收时间的影响。α-愈创木烯、刺蕊草烯、α-布藜烯等成分在挥发油中的含量超过3%，在昼夜变化过程中具有基本相同的动态变化趋势，且均在18：00时含量达到最大值。β-榄香烯、石竹烯、葎草烯3种化学成分的含量在1 d中呈现相似的变化趋势，其中石竹烯、葎草烯含量在 06：00 达最高值，β-榄香烯含量在06：00和21：00达最高值。然而β-广藿香烯和法呢醇在24 h内常会出现相反的变化趋势，09：00时法呢醇的含量达到最高值，β-广藿香烯含量则达到最低值。

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