4株芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

石水琴， 蒋 雯， 袁 林， 祁克宗， 涂 健， 宋祥军

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036； 2.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036； 3.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

嗜热微生物是一类可以在45 ℃以上环境中生长繁殖的极端微生物，因其细胞和蛋白质具有独特的耐热性，已引起广泛关注，并且逐渐成为人们开发利用的重要微生物资源。世界各国科学家不断从各种自然高温生态环境、地热环境中筛选和分离出不同属、种的嗜热菌[1]。嗜热菌在实际应用中表现出显著的作用效果和潜在的应用前景。农业生产中的肥料、饲料及环境保护中常用的微生物活菌制剂包括多种微生物，其中芽孢杆菌是一类需氧或兼性厌氧菌，菌体本身含有大量的营养物质，随着它们在动物消化道内的繁衍、代谢，可产生维生素、有机酸、蛋白质和未知生长因子等，参与机体新陈代谢，同时还具有生物拮抗功能，可以减少动物肠道有害菌的数量，维持消化道菌群平衡[2-5]，在实际生产中得到了广泛的应用。

目前我国允许作为生态制剂的微生物有乳酸菌制剂、粪肠球菌制剂、芽孢杆菌制剂、酵母菌制剂和复合微生态制剂等。但通常使用的益生菌菌株的抗逆性较差，不耐热，在饲料加工过程中损失较大，不能像芽孢杆菌可以直接加到配合饲料中，因此嗜热芽孢杆菌作为益生菌的一种，具有其特有的生物特性。与其他微生物活菌制剂相比，芽孢杆菌具有在条件不利的环境下形成芽孢将自己保护起来的特点，且复活率高。同时芽孢杆菌还具有耐酸、耐盐、耐高温及耐积压等优点[6-8]，因此在饲料、肥料的生产中具有较高的稳定性。目前在肥料、饲料工业及环保中应用的主要有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等，在使用时多制成休眠状态的活菌制剂或与乳酸菌混合使用[9]，有益的芽孢杆菌能促进机体免疫器官及组织的成熟，使这些器官、组织处于高度准备状态，可促进T-淋巴细胞、B-淋巴细胞数量增加，从而提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，因此，芽孢杆菌在动物和人体的微生态调节中也得到了高度的重视和广泛的应用。

本研究以水产饲料为材料，采用常规细菌分离鉴定法结合分子生物学法从水产饲料中分离鉴定出4株嗜热芽孢杆菌，并对菌株的耐高温、耐酸、耐胆盐及对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌性等一系列生物学特性进行研究，为后续试验以及微生态饲料添加剂的开发及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为水产饲料蛋白粉，购自当地市场。

1.2 培养基

1.2.1 摇瓶培养基 称取2.5 g LB培养基溶于100 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃备用。

1.2.2 产蛋白酶初筛选择性培养基 干酪素8 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1 g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.36 g，琼脂20 g，氯化钠(NaCl)5 g，加入1 000 mL蒸馏水，加热搅拌，pH值7.4±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃备用。

1.2.3 产淀粉酶初筛选择性培养基 牛肉浸膏5 g，酪蛋白水解物17.5 g，淀粉1.5 g，琼脂13.5 g，加入1 000 mL蒸馏水，加热搅拌，pH值7.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃保存备用。

1.3 芽孢杆菌的分离、纯化

取2 g样品溶解到20 mL无菌水中，振荡溶解。取混合液接种到20 mL LB液体培养基中，于45 ℃振荡(150 r/min)培养24～48 h，待培养基变得混浊后，取1 mL培养液按一定的稀释度稀释，涂布于LB固体培养基上，置于50 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，挑取单菌落，接于新鲜培养基上，重复多次直至菌落纯化。选取生长较好的A2、A3、A4、A5菌株进行理化性质的研究。

1.4 生长曲线及最适生长条件测定

生长曲线的测定：将菌液按1%的比例接种到100 mL LB培养基中，45 ℃振荡培养，每2 h测定1次。

菌株最适生长温度的测定：将处于对数生长期早期的LB菌株培养液0.5 mL接种到5 mL LB培养基中，分别置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴振荡培养18 h。

最适生长pH值的测定：将处于对数生长期早期的LB菌株培养液0.5 mL分别接种到pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的5 mL LB液体培养基中，置于45 ℃水浴振荡培养18 h。

以上试验均设平行。用721型分光光度计比色测定D600 nm进行生长条件的分析。

耐胆盐试验：菌液按1 ∶50(体积比)的接种量分别接种于胆盐浓度为0、3、6 g/L的液体培养基中，每组重复3次，45 ℃、200 r/min 振荡培养12 h后测定菌液的D600 nm。

1.5 产淀粉酶和蛋白酶试验

产淀粉酶试验：首先配制产淀粉酶初筛试验的MH培养基，121 ℃高压灭菌15 min，制成平板备用；将分离出来的A2、A3、A4、A5菌株分别接种于装有LB液体培养基的试管中，45 ℃、200 r/min振荡培养(12±2)h；将培养好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL点样于产淀粉酶培养基上，在(45±1)℃恒温培养箱内培养24 h，待长出单菌落，滴入卢戈氏碘液覆盖菌落，观察是否产生透明圈。

产蛋白酶试验：首先配制产蛋白酶初筛试验培养基，121 ℃ 高压灭菌15 min，制成平板备用；将分离出来的A2、A3、A4、A5菌株分别接种于装有LB液体培养基的试管中，45 ℃、220 r/min振荡培养(12±2)h；将培养好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL点样于产蛋白酶培养基上，在45 ℃恒温培养箱内培养24 h，待长出单菌落，检察是否产生蛋白酶水解圈。

1.6 抑菌试验

试验菌株菌液、大肠杆菌(ATCC 44102)及沙门氏菌菌液，分别以体积比1 ∶50(约1×106CFU/mL)的接种量同时接种于 10 mL 肉汤液体培养基中，另以灭菌生理盐水替代试验菌株作为阳性对照。每组设3个重复，37 ℃、200 r/min培养24 h。采用平板活菌计数法，取样涂布于麦康凯琼脂平皿，37 ℃过夜，红色菌落为大肠杆菌，其余为沙门氏菌，记录大肠杆菌和沙门氏菌菌落数，计算各试验菌株对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率。

1.7 分子鉴定

用16S rDNA序列进行鉴定，以确定其归属。PCR产物送上海捷瑞生物工程有限公司测序。分别将获得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行Blast比对，选取相似度95%以上的序列进一步分析。然后采用DNAMAN 5.2.9软件进行分析，绘制系统发育树。

1.8 透射电镜观察

处于对数生长期早期的细胞用固定液固定好后，制备超薄切片置于透射电镜下进行结构观察。

2 结果与分析

2.1 分离的菌落及形态结构观察

通过稀释平板涂抹法分离得到4株芽孢杆菌，将其接种到普通营养琼脂培养基上，45 ℃恒温培养24～48 h后观察，菌落为圆形，边缘不规则，表面有皱襞。挑取单个菌落涂片，可见呈革兰阳性。透射电镜观察看到4株芽孢杆菌细胞呈直杆状，常以成对或链式排列，具圆端，都具有明显的细胞壁结构，且都能明显观察到周围有菌毛，如图1所示。

2.2 分离株的生化鉴定

对4株菌株的细菌形态特征、革兰氏染色观察以及触酶与发酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常规生化试验结果如表1所示。

表1 4株参试菌的生理生化特征

注：“+”表示阳性或能利用；“-”表示阴性或不能利用；“+/-”表示同一属具体不同菌株之间的细微差别。

2.3 最适生长条件

2.3.1 生长曲线的测定 从0 h开始，每2 h测1次D600 nm，直到30 h，4株菌株基本进入稳定期。如图2所示，A2、A3、A4、A5菌株均在12 h达到对数期，分别在26、20、20、 26 h 达到稳定期。

2.3.2 菌株最适生长温度的测定 将4株菌株置于不同温度摇床培养，在18 h后同时测定菌液的D600 nm，以空白培养基作为对照，得到的结果如图3所示，可见培养温度对4株菌株的生长有一定的影响。在所选温度范围内，菌体生物量随温度的变化而变化，当培养温度低于40 ℃时，菌体生长缓慢；A2、A4、A5菌株培养温度在40～45 ℃之间时，菌体生长情况较好，以45℃最好，之后随着温度的升高，生长速度减慢。A3菌株在50 ℃时菌体生物量达到最高值。

2.3.3 菌株最适生长pH值的测定 将4株菌株置于不同pH值条件下，在45 ℃恒温培养18 h后同时测定菌液的D600 nm，以空白培养基作为对照，测得的结果如图4所示：初始pH值对4株菌株生长有明显的影响，当培养基pH值低于6.0时，菌体生长缓慢，当初始pH值在6.0～7.5之间时，菌体生长情况较好。A2、A3菌株最适pH值为7.5，A4、A5菌株最适pH值为7.0。

2.4 耐胆盐试验

由图5可见，4株菌株各组的生长都受到胆盐的抑制，D600 nm都低于不含胆盐组，相比较而言，A2菌株耐受性较好。

2.5 产蛋白酶和淀粉酶结果分析

4株菌株产蛋白酶和淀粉酶结果如图6所示，A2、A3菌株产淀粉酶，A4、A5菌株基本不产淀粉酶(图6左图)；4株菌株均能产蛋白酶，且A2菌株产蛋白酶能力最强(图6右图)。

2.6 抑菌试验

由表2可见，4株菌株对共同培养24 h的大肠杆菌都没有抑制作用；A2、A5菌株对共培养的沙门氏菌的抑菌率分别为31.2%、22.9%，其他菌株为0。

表2 各菌株对共培养的大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果

2.7 16S rDNA基因系统发育分析

测序获得的A2、A3、A4和A5菌株16S rDNA基因片段长度分别为1 277、1 181、1 213和909 bp。利用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，将所测菌株A2、A3、A4和A5的16S r DNA序列与GenBank数据库中已知细菌的16S rDNA序列进行比较鉴定，已知A3、A4、A5菌株与Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分别为98%、99%、100%，说明A3、A4和A5菌株属于嗜热地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)；已知A2与Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，说明A2菌株属于嗜热枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)。采用DNAMAN 5.2.9软件绘制的系统发育树见图7。

3 讨论

从水产饲料中分离获得4株菌株，细菌形态特征、革兰氏染色等鉴定结果显示，4株菌株与芽孢杆菌相似。由于芽孢细菌形态特征及其生理生化特性极其相似，因此仅通过形态特征及其生理生化特性只能初步确定这4株菌株为芽孢杆菌。基于16S rDNA特异性PCR扩增的检测等多种方法结合使用，经鉴定，A2菌株与Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，说明A2菌株属于嗜热枯草芽孢杆菌；A3、A4、A5菌株与Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分别是 98%、99%、100%，说明A3、A4和A5菌株属于嗜热地衣芽孢杆菌。

本研究以水产饲料为材料，分离筛选优良的芽孢杆菌菌株并对其进行初步鉴定，以此大致了解水产饲料中芽孢杆菌的菌相构成。在此基础上探究了芽孢杆菌对常见致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用，以期研究结果能为畜牧农业生产及微生态调节剂的制备提供前期理论依据和优良的微生物资源。

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