基于主成分及聚类分析的虎杖产量与品质的综合评价

杨玉霞， 陈雪飞， 张 美， 胡 平， 夏燕莉， 詹志来， 曹 柳，3

(1.四川省中医药科学院，四川成都 610041； 2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700； 3.四川省医学科学院/四川省人民医院，四川成都 610072)

虎杖为蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根茎和根，性微苦，微寒，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的功效，临床上主要用于关节痹痛、湿热黄疸、经闭、咳嗽痰多、水火烫伤、跌打损伤、痈肿疮毒等病症的治疗[1]，其主要有效成分为虎杖苷、白藜芦醇、大黄素等。其中，虎杖苷具有镇咳、保肝、抗休克及抑制血小板聚集等作用[2-4]；大黄素有较广泛的生物活性，具有抑菌、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等作用[5-6]。《中华人民共和国药典》中虎杖项下以大黄素、虎杖苷的含量作为虎杖的质量控制指标[1]。近年来，由于过度采挖，野生虎杖资源遭受严重破坏，因此人工栽培成为解决虎杖资源枯竭问题、满足市场需求的有效途径之一。

主成分分析法是将众多指标性状转化为少数综合指标的一种统计分析方法，将复杂问题通过降维方式变得简单直观，目前已被广泛应用于果蔬品质评价因子的筛选和品质的综合评价。虎杖具有丰富的遗传多样性，其经济性状尚待深入研究。有学者主要对虎杖的化学成分[7-12]、药理作用[13-21]及临床应用[22-27]等进行了研究，尚未有采用主成分和聚类分析方法综合研究虎杖产量和品质的报道。本试验以19份虎杖作为研究对象，通过主成分及聚类分析方法对其产量和品质性状进行综合评价，以寻求虎杖产量与品质评价的主要因素，为构建川产虎杖的产量和质量综合评价体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来源于四川省乐山市、雅安市、广安市、巴中市及重庆市等地，共19份，均为野生居群，经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为虎杖(Polygonumcuspidatum)。样品来源如表1所示。

表1 供试材料编号及来源

1.2 仪器与试剂

主要仪器有Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司)、电子分析天平(德国Sartorius BS110S型十万分之一)、KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、DHG-9140电热鼓风干燥箱。

主要试剂有虎杖苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15051307)、大黄素对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15042711)，纯度均大于98%；乙腈(批号：905904)、甲醇(批号：905900)均为色谱纯，均购自美国天地有限公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 田间试验 2013至2015年在四川省乐山市犍为县五四村虎杖试验地进行试验。试验地之前种植的作物为玉米，地势平坦，肥力均匀，壤土，土壤理化性质为pH值7.53，全钾、全氮、全磷、有机质的含量分别为46.77、0.72、0.15、94.40 g/kg，速效氮、有效磷、速效钾含量分别为154.40、56.27、184.35 mg/kg。采用随机区组设计，重复3次，小区面积为3.6 m2(3.0 m×1.2 m)，株行距为40 cm×60 cm，共6行，每行4株，每小区共栽种24株，栽培及田间管理同大田生产中各项措施。2015年8月随机取10株虎杖，考察株高、茎粗、主茎叶数、分枝数及单株产量(以单株根及根茎鲜质量计)等农艺性状，并以平均值进行统计分析。

1.3.2 虎杖苷及大黄素含量的测定

1.3.2.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax Eclipse C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～13 min，20%～40% A；13～22 min，40%～80% A；22～23 min，80%～20% A)；流速为1 mL/min；检测波长为299 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

1.3.2.2 混合对照品溶液的制备 取虎杖苷和大黄素对照品适量，精确称定，加入甲醇配制成含226 μg/mL虎杖苷、217 μg/mL大黄素的对照品溶液。精确吸取3 mL虎杖苷对照品溶液、2 mL大黄素对照品溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得到混合对照品溶液。

1.3.2.3 供试品溶液的制备 精确称取各产地0.1 g的虎杖粉末置于具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，精确称定质量，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，得到供试品溶液。

1.3.2.4 线性关系考察 分别精确吸取0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μL大黄素对照品溶液注入液相色谱仪，按 “1.3.2.1” 节下色谱条件测定大黄素峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)进行回归分析，得回归方程：y虎杖苷=114 8.4x+54.279 0(r=0.999 8)；y大黄素=1 594.2x+0.340 1(r=0.999 9)，虎杖苷在0.018 1～3.616 0 μg、大黄素在0.004 3～0.868 0 μg内呈良好的线性关系。

1.3.2.5 样品测定 取适量供试材料样品，按“1.3.2.3”节中的方法制备供试品溶液，同时按“1.3.2.1”节中色谱条件测定，采用外标一点法计算虎杖药材中虎杖苷及大黄素含量。

1.4 数据统计分析

利用Excel进行数据平均值、标准差及变异系数的分析；利用DPS 7.05软件[28]进行相关、主成分及聚类分析；依据方差累计贡献率≥85%的标准提取主成分，以各主成分对应的方差贡献率作为权重，对主成分得分和相应的权重进行线性加权，构建川产虎杖居群的评价函数；主成分聚类分析按欧式距离类平均法进行系统聚类。

2 结果与分析

2.1 虎杖主要农艺性状、虎杖苷及大黄素含量表现

由表2可以看出，虎杖不同居群间10个农艺性状以及虎杖苷、大黄素含量的变异幅度较大。

表2 虎杖主要农艺性状、虎杖苷及大黄素含量的表现

变异系数是衡量性状表现的差异程度、变异范围的量。供试材料12个性状的变异系数存在明显差异，变异系数由大到小排序为大黄素含量>虎杖苷含量>分枝数>茎叶鲜质量>冠幅>茎粗>主根粗>主根长>单株产量>侧根数>主茎叶数>株高。大黄素含量、虎杖苷含量、分枝数、茎叶鲜质量的变异系数较大，均在25%以上，说明这些性状选择的潜力大，受环境影响较大。株高、主茎叶数、侧根数的变异系数相对较小，均在15%以下，说明这些性状由本身内在因素决定，受环境因素的影响较小。因此，改善环境，提高分枝数、茎叶鲜质量，进而提高单株产量以及大黄素、虎杖苷的含量是实现虎杖高产优质的有效途径。

2.2 虎杖主要农艺性状、虎杖苷及大黄素含量的主成分分析

对虎杖主要性状进行主成分分析，结果表明，前5个主成分的累计贡献率为88.724%>85.000%(表3)，说明前5个主成分已基本包含了虎杖性状的全部信息，可用前5个主成分对其进行综合评价。第1主成分的特征值为3.736，贡献率为31.134%。决定第1主成分的主要是株高、茎粗、主茎叶数、冠幅及单株产量，其载荷值均为正值，称为株型产量因子。第2主成分的特征值为3.201，贡献率为26.677%，决定第2主成分的主要是主根长、侧根数，其次为主根粗，其载荷值均为正值，称之为根型因子。第3主成分的特征值为 1.942，贡献率为16.184%，起决定作用的是分枝数，称为分枝因子。第4主成分的特征值为1.050，贡献率为8.750%，起决定作用的为虎杖苷含量及茎粗，其载荷值为较大正值，称为虎杖苷-茎粗因子。第5成分的特征值为0.717，贡献率为 5.979%，起决定作用的是虎杖苷及大黄素含量，其载荷值均为正值，而单株产量的载荷值为较大负值，称为优质低产因子。

2.3 不同虎杖居群的综合评价

以各主成分对应的方差贡献率作为权重，对主成分得分和相应的权重进行线性加权，构建虎杖评价函数：F=0.311 3F1+0.266 8F2+0.161 8F3+0.087 5F4+0.059 8F5，计算各居群的综合评价分值，分值越高表示该居群综合评价越好。

表3 5个主成分的特征值、贡献率、累计贡献率及其特征向量

在主成分综合统计结果基础上计算出供试的19份虎杖的产量和品质的综合评价得分(表4)。结果表明，在所有的供试材料中，来自重庆市奉节县小寨天坑(材料19)的评价得分最高(1.992)，其次为材料15和材料10，其综合评分均在0.700以上，材料7和材料9的评价得分均在-1.000以下，编号为2、3、18等8份材料的评价得分在-0.700～0.000内，来自成都市大邑县出江镇香桂村1组(材料7)的评价得分最低(-1.343)。

2.4 虎杖产量与品质性状的聚类分析

根据不同产地虎杖居群产量与品质性状，可将19份种质资源分成3类。由表5、图1可以看出，材料19单独成Ⅰ类，该类分枝数最多、主根长较长，其他性状中等偏上，属于高产优质型材料。第Ⅱ类由3、4、7、18等9份材料组成，该类侧根数最多，虎杖苷含量最高，株高、茎粗、主茎叶数、单株产量、大黄素含量等均最低，属于矮秆低产型材料。第Ⅲ类由1、2、5、17等9份材料组成，此类材料株高、茎粗、主茎叶数、冠幅、茎叶鲜质量、单株产量、大黄素含量均最高，但虎杖苷含量最低，属于高产高大黄素含量型材料。

表4 19份虎杖的产量与品质的综合评价得分

表5 基于虎杖主要农艺性状及虎杖苷及大黄素含量的分类

3 结论与讨论

在所有的供试材料中，材料19的综合得分最高，为 1.992；其次为材料15，综合得分为0.936。但从产量而言，15号材料表现较优，其单株产量较高、分枝数较多、茎叶鲜质量较高，虎杖苷与大黄素的含量也较高，值得进一步选育推广。本试验分析的是各农艺性状对单株产量的结果，对于群体产量结果如何，还要进一步探讨。

在各种问题的多指标分析中，指标的数量多又相互关联，分析工作比较困难。多元统计的主成分分析是指在不损失或很少损失原有信息的前提下，将原来数量较多而且彼此相关的指标转换为新的数量少而彼此独立或不相关的综合指标，从而简化多指标分析[29]。很多研究表明，用主成分分析方法进行综合评价是一种有效的方法[30-31]。本试验采用主成分分析方法，将19份虎杖种质资源的10个农艺性状和2个质量性状简化为彼此不相关的综合指标(主成分)，即株型产量因子、根型因子、分枝因子、虎杖苷-茎粗因子和优质低产因子，这5个主成分对总变异的累积贡献率约达85.000%以上。从主成分综合质量评价结果可以看出，3类虎杖种质资源均有各自不同的优良特性，可从中选择优质种质资源并加以推广，加快虎杖优良品种的选育工作。

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