吡嘧磺隆对不同种群野慈姑生理生化指标的影响

芮 静， 刘 英， 赵长山

(东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨 150030)

野慈姑(SagittariatrifoliaLinn.)别称狭叶慈姑、三脚剪、水芋，多年生水生或沼生草本，为慈姑的变种，与慈姑相比，野慈姑植株较矮，叶片较小、薄。苗期为4～6月，花期为夏秋季，果期为秋季。块茎或种子繁殖，分布于全国各地。野慈姑为水稻田常见杂草，北方部分水稻种植区，有时发生较重。吡嘧磺隆为水稻田常用除草剂，可以防除1年生和多年生阔叶杂草与莎草科杂草，如野慈姑，最适宜施药时期是水稻的苗后早期。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，简称ALS)主要存在于高等植物的叶绿体基质中，是除草剂吡嘧磺隆的作用靶标。ALS活性下降能阻碍支链氨基酸、蛋白质的合成，影响植物细胞有丝分裂，同时导致植物组织失绿、黄化，破坏植物正常生长，使植物逐渐死亡[1]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是植物体内的抗氧化酶，在保护生物膜系统免受活性氧伤害方面能发挥很重要的作用[1]。目前对这些酶活性在低温、干旱、病虫害等不利于植物生长的环境下发挥的保护作用报道很多[2-4]，也有试验表明杂草种群SOD活性能反映杂草对除草剂的抗药性。通过测定不同种群野慈姑的ALS活性、SOD活性和叶绿素含量，以期为研究吡嘧磺隆对野慈姑生理生化指标的影响提供一定的理论依据，在酶水平上初步探究野慈姑不同种群对吡嘧磺隆敏感性的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

于2014年春季在黑龙江省5个不同地区[鸡东县鸡林朝鲜族乡(H1)、铁力市双丰镇卫东村(H2)、宝清县和平村(H3)、五常市志广乡范家屯(H4)、鸡东县石河村(H5)]的水稻田采集野慈姑球茎。

供试药剂为10%吡嘧磺隆可湿性粉剂(日产化学工业株式会社)。

试验仪器主要有VXE380超低温冰箱(赛默飞世尔公司)、MR23i高速冷冻离心机(法国Jouan公司)、HWS-28电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 试验方法

采用室外盆栽法，于2015年5月30日从不同地区采集的野慈姑球茎播于塑料盆中，塑料盆直径为15 cm，每盆播种8粒球茎，播深3～5 cm，正常水分管理，并于2015年6月4日(野慈姑播种后但即将出土前)用吡嘧磺隆进行土壤封闭处理(9个)，施药量分别为15、30、45、60、75、150、300、450、600 g a.i./hm2、，并设清水对照(CK)，共10个处理，每个处理重复3次。于施药后7 d采取野慈姑挺水叶叶片为样本，样品取回后保存在-80℃的超低温冰箱中待用。

1.2.1 乙酰乳酸合成酶活性的测定方法 参考隋标峰的方法[1]测定乙酰乳酸合成酶活性。

1.2.2 SOD酶活性的测定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，简称NBT)还原法[5]，至反应结束后，以不进行光照的对照管作空白对照，分别测定其他各管在560 nm处的吸光度，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位表示。

1.2.3 叶绿素含量的测定方法 采用80%丙酮溶液法[6]，将采回的叶片用自来水洗净擦干后吸去叶表水分，称0.2 g样品进行叶绿体色素提取。在分光光度计上测定叶绿素在波长为645、663 nm处的吸光度，然后根据以下公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和叶绿素的总量：

叶绿素a浓度：Ca=12.72D663 nm-2.59D645 nm；

叶绿素b浓度：Cb=22.88D645 nm-4.67D663 nm；

叶绿素总浓度：Ct=Ca+Cb=20.29D645 nm+8.05D663 nm；

1.3 数据统计与处理

试验原始数据均录入Excel软件后进行统计、计算分析。

2 结果与分析

2.1 吡嘧磺隆对乙酰乳酸合成酶活性的影响

由图1可知，在不同地区采集的野慈姑种群的ALS活性随着吡嘧磺隆用量的增加整体呈下降趋势。野慈姑种群H5的ALS活性下降幅度最大，说明吡嘧磺隆对种群H5的抑制作用最大，H2次之，对吡嘧磺隆最不敏感的为种群H1。

在75 g a.i./hm2吡嘧磺隆剂量下，种群H2的ALS酶活性最低，为54.80%，种群H1的ALS活性最高，为 70.35%，说明在此剂量下，种群H2对吡嘧磺隆最为敏感，种群H1对吡嘧磺隆敏感性较低；在 600 g a.i./hm2吡嘧磺隆剂量下，H5的ALS活性最低，为17.63%，种群H1的ALS活性最高，为53.41%，说明在此剂量下，种群H5对吡嘧磺隆最为敏感，而种群H1对吡嘧磺隆最不敏感。

2.2 吡嘧磺隆对超氧化物歧化酶活性的影响

由表1可知，未使用吡嘧磺隆进行药剂处理时，不同野慈姑种群自身SOD活性并不相同。SOD活性较高的是种群H1和H3，其次是种群H2，种群H4和种群H5的SOD活性相对偏低。

表1 吡嘧磺隆对不同野慈姑种群SOD活性的影响

注：同列数据后不同大写、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上差异显著。

对野慈姑种群进行施药处理，能够使其体内SOD活性发生变化。吡嘧磺隆施药量在15～75 g a.i./hm2范围内，种群H1体内SOD活性与对照无显著差异；施药量在150～600 g a.i./hm2时，种群H1体内SOD活性与对照差异显著，体内SOD活性有逐渐下降趋势。吡嘧磺隆施药量在15～75 g a.i./hm2范围内，种群H2与对照差异极显著，体内SOD活性呈波浪式变化。吡嘧磺隆施药量在15～600 g a.i./hm2时，种群H3与对照未达到极显著差异。种群H4在吡嘧磺隆施药量15～60 g a.i./hm2范围内与对照无显著差异；在施药量75～600 g a.i./hm2范围内，与对照差异显著(除 450 g a.i./hm2剂量外)。除吡嘧磺隆施药量为 15 g a.i./hm2外，其他各处理的种群H5体内SOD活性均与对照有极显著差异。

吡嘧磺隆对野慈姑种群H1、H2体内SOD活性影响较小，不同处理SOD活性水平相对较高，能在一定程度上减轻吡嘧磺隆对野慈姑的伤害；吡嘧磺隆对野慈姑种群H5体内SOD活性影响较大，减轻吡嘧磺隆对野慈姑伤害的能力较弱；种群H3、H4体内SOD活性在吡嘧磺隆施药量较低时，能减轻对野慈姑的伤害，但在高浓度时，保护野慈姑的这种能力下降。

2.3 吡嘧磺隆对野慈姑叶绿素含量的影响

随着吡嘧磺隆用药量的增加，野慈姑叶片颜色逐渐褪绿黄化，严重时叶片向内卷曲、茎颜色褪绿黄化，但不同野慈姑种群的叶片褪绿黄化程度不同。由图2可知，施药后7、15、21 d野慈姑体内叶绿素含量随吡嘧磺隆用量的增加整体呈下降趋势。

施药后7 d，除种群H4在吡嘧磺隆施药量为15、30 g a.i./hm2，种群H5在吡嘧磺隆施药量15 g a.i./hm2时的叶绿素含量高于对照外，其他处理的叶绿素含量均低于对照。与对照叶绿素含量相比，叶绿素含量下降最多的是种群H1，最少的是种群H4。

施药后15、21 d，随着施药量的增加，不同种群的叶绿素含量整体均呈逐下降趋势。施药后15 d，与对照叶绿素含量相比，叶绿素含量下降最多的是种群H1，其次是种群H3，最少的是种群H4；施药后21 d，与对照叶绿素含量相比，叶绿素含量下降最多的是种群H4，其次是种群H2，最少的是种群H1。说明吡嘧磺隆能够在一定程度上降低种群叶片中的叶绿素含量，从而影响植物的光合作用。

3 结论与讨论

ALS活性是鉴定杂草对ALS抑制剂产生抗性的重要生理生化指标。崔海兰在播娘蒿对苯磺隆的抗药性研究中明确指出，与敏感种群相比，抗药性种群的ALS对苯磺隆的敏感性下降，且抗药性生物型的ALS 序列在相对于197位的脯氨酸上发生了突变[7]；Hwang等在研究抗ALS抑制剂的鸭舌草时明确指出，鸭舌草对其不敏感[8]。本研究结果表明，在施药量为15～600 g a.i./hm2范围内，不同种群体内ALS活性随着吡嘧磺隆施药量的增加而下降，下降幅度最大的是种群H5，其体内ALS活性从86.04%下降到17.63%；降低幅度最小的是种群H1，其体内ALS活性从98.24%降低到53.41%。

随着吡嘧磺隆施药量的增加，不同种群SOD活性变化幅度不同，种群H1自身SOD活性偏高，而种群H5自身SOD活性偏低。说明SOD活性的变化不是影响野慈姑产生抗性的主要因素。

施药后7、15、21 d后，野慈姑体内叶绿素含量基本呈下降趋势，随着时间的推移，吡嘧磺隆对野慈姑体内的叶绿素含量抑制作用加大。

每年都会增加一定数量的抗药性杂草，杂草的抗药性问题应得到密切关注[9-10]。在抗药性杂草治理方面，应多汲取前人的经验，除加强抗药性杂草的检测和抗药性机制方面外，应多注意除草剂的交替、轮换使用，延缓抗药性杂草的发生，延长除草剂的使用期限等[11]。充分掌握杂草的生物学特性，使之与农业耕作措施相结合，更能从根本上解决抗药性杂草发生的问题。

[1]隋标峰. 麦田杂草对苯磺隆敏感性差异的生理生化机制研究[D]. 泰安：山东农业大学，2007.

[2]丁 伟，陶 波，程 茁，等. 甜菜对豆磺隆敏感性与质膜过氧化关系的研究[J]. 东北农业大学学报，2005，36(5)：556-560.

[3]吴进才，刘井兰，沈迎春. 等. 农药对不同水稻品种 SOD 活性的影响[J]. 中国农业科学，2002，35(4)：451-456.

[4]张沙艳，高成华. 玉米超氧化物岐化酶(SOD)的分离及纯化[J]. 沈阳师范大学学报(自然科学版)，2006，24(2)：231-233.

[5]张志良，瞿伟菁. 植物生理学实验指导[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2003：268-269.

[6]王学奎，黄见良. 植物生理生化实验原理与技术[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2015：131-133.

[7]崔海兰. 播娘蒿(Descurainiasophia)对苯磺隆的抗药性研究[D]. 北京：中国农业科学院，2009.

[8]Hwang I T，Lee K H，Park S H，et al. Resistance to acetolactate synthase inhibitors in a biotype ofMonochoriavaginalisdiscovered in Korea[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2001，71(2)：69-76.

[9]左平春，臧晓霞，陈仕红，等. 稻稗对唑酰草胺的非靶标抗药性和对氰氟草酯的交互抗药性[J]. 杂草学报，2016，34(4)：28-32.

[10]颜欣茹，杨俊雪，薛 君，等. 抗性和敏感生物型菵草代谢精唑禾草灵的速度差异[J]. 杂草学报，2017，35(1)：15-19.

[11]李平生，魏松红，纪明山，等. 野慈姑对ALS抑制剂的交互抗药性[J]. 农药，2015，54(5)：366-368.