不同菌肥对土壤养分、酶活性和微生物功能多样性的影响

王梦雅，符云鹏*，贾 辉，张晓娟，赵兵飞，宋显峰

土壤微生物是土壤有机质以及养分转化和循环的动力，参与到土壤生态系统的各个环节[1]，通过添加菌肥来增加土壤微生物种群和数量已成为改善土壤质量常用的措施。菌肥施入土壤会使土壤微生物大量繁殖。微生物吸收肥料中的营养物质转变为自身的机体物质，之后死亡完成了无机养分有机化，可以减少淋溶和挥发造成的养分损失。现如今，较为常用的菌肥为微生物菌剂和生物有机肥，其中微生物菌剂是经过特殊工艺制成的含有活菌的制剂[2]；生物有机肥是由有益微生物活菌与有机肥结合制成的微生物有机复合肥料[3]。土著菌扩繁剂是近年来中国农业科学院烟草研究所最新研制的产品，它是利用驯化的高抗逆性微生物对大豆进行低温有氧发酵后制成的一种有益的微生物田间扩繁剂，能迅速在肥料表面形成胶体膜，构成有益微生物培养基，从而使土著菌扩繁剂本身含有的微生物和土壤中本土微生物大量繁殖，但目前还未得到广泛应用。

施用菌肥对土壤的影响虽已有大量的研究，但主要集中在单一菌肥不同施用量的研究[4-5]，对于不同菌肥施用后的效果对比分析相对薄弱。因此本试验初步研究了向绿肥翻压后的植烟土壤中施用微生物菌剂、土著菌扩繁剂、生物有机肥等菌肥后土壤的有机质和养分状况，并重点研究了酶活性、土壤呼吸及微生物功能多样性指标的变化，以期为制定优质的施肥措施，提高土壤养分及生物性质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

试验于2016年4—10月在平顶山市郏县李口镇进行，供试烟田为旱地，土壤为褐土，其基本理化性质为：有机质19.36 g/kg，速效氮87.13 mg/kg，速效磷14.28 mg/kg，速效钾84.49 mg/kg。供试品种为当地主栽品种中烟100。

1.2 试验设计

试验设4个处理：CK，在黑麦草翻压的基础上常规施肥；T1、T2、T3分别在 CK的基础上添加30 kg/hm2的微生物菌剂（有效微生物含量100亿/g）、11.25 kg/hm2的土著菌扩繁剂（有效微生物含量80亿/g，N、P2O5、K2O含量分别为3.72%、1.08% 、0.88%）、600 kg/hm2的生物有机肥（有效微生物含量2亿/g，N、P2O5、K2O含量分别为1.82%、2.68% 、3.08%），菌肥的施用量按照产品介绍最优施用量施入。试验设3次重复，随机区组排列，小区面积为244.57 m2。试验用微生物菌剂和生物有机肥为河南省鹤壁市禾盛生物科技有限公司提供，土著菌扩繁剂（商品名为纳米酵豆）由中国农业科学院烟草研究所提供。黑麦草于2015年11月初播种，于2016年3月底翻压，翻压量为2.67 t/hm2。翻压时全碳含量为34.9%，全氮含量为1.05%，全磷含量为0.21%，全钾含量为2.37%。

常规施肥氮用量为30 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶2∶9，其中烟草专用复合肥（10∶10∶20）用量为 30 kg/hm2，芝麻饼肥（4% N）675 kg/hm2，黄腐酸钾（9.2% K2O）375 kg/hm2，磷、钾不足部分分别由重过磷酸钙（40% P2O5）和硫酸钾（50%K2O）补充。黄腐酸钾、硫酸钾、重过磷酸钙和70%芝麻饼肥作基肥条施，30%芝麻饼肥和烟草专用复合肥与菌肥混匀之后于移栽时穴施。各处理烟株行距1.2 m，株距0.5 m，于2016年5月3日移栽，2016年9月15日采收结束。田间烟草栽培管理措施按照平顶山市烟草种植标准化操作进行。

1.3 土样采集与测定指标

烟株旺长期（移栽后60 d）每个小区多点混合采集0～20 cm土样，一部分过2 mm筛后放于4 ℃冰箱保存用于测定土壤脲酶、蔗糖酶活性以及细菌功能多样性；其余挑出根须、石头等杂物后风干过不同目筛后分别用于测定土壤有机碳、碱解氮、速效钾、速效磷的含量。

1.4 测定方法

土壤基本理化性质的测定采用常规方法[6]，有机碳采用重铬酸钾-外加热法测定；采用碱解扩散法测定碱解氮含量；采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法测定速效磷含量；采用NH4OAC浸提火焰光度法测定速效钾含量。脲酶采用靛酚比色法测定，其活性以24 h后土壤中生成的NH4+-N量表示；蔗糖酶用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[7]，其活性以24 h后产生的葡萄糖的量来表示。

土壤呼吸在烟株旺长期（移栽后 60 d）采用Li-COR8100A土壤碳通量自动测量仪于晴朗无风天气上午 9∶00—11∶00 测定[8]。

细菌代谢功能多样性的检测[9]，采用 96孔BIOLOGECO板进行培养试验，其含有31种碳源，25 ℃恒温培养，在24、48、72、96、120 h后测定各孔在590 nm波长下的光吸收值。

1.5 数据处理

采用Excle 2013、SPSS 20.0和R语言进行数据分析和处理，采用origin 9.0进行绘图。

对于Biolog数据，选取培养120 h的结果进行分析，利用平均颜色变化率（AWCD）来反映微生物活性，利用Shannon指数来反映群落物种的丰富度，利用Simpson指数来反映土壤微生物群落的优势度，利用Mcintosh指数来表征微生物群落的均匀度。

计算公式如下[10]：

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中，Ci为每孔在590 nm下的吸光值，R为ECO板上对照孔Ai的吸光值，31为ECO板上碳源的种类数。Ci-R＜0 的孔，全记为零；

Shannon 指数=-∑pi×logpi

式中，pi为第i孔相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；

Mcintosh指数＝(∑ni2)1/2

式中，ni为第i个碳源孔的相对OD值（即Ci-R），该试验中为31；

Simpson指数＝1-∑pi2

式中，pi为第i孔相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。

2 结 果

2.1 不同菌肥对土壤有机碳和速效养分的影响

由表1看出，施入菌肥后的处理除碱解氮以外的各养分含量较CK均显著提高，并且以T2处理增加量最大，有机碳、速效磷、速效钾含量分别增加了7.82%、39.19%、48.95%。T2碱解氮含量显著低于CK，其他处理间差异不显著。

2.2 不同菌肥对土壤主要酶活性的影响

图 1表明，脲酶活性表现为T2＞T3＞T1＞CK，其中T2和T3脲酶活性无显著差异。图2表明，施用菌肥处理的蔗糖酶活性均显著高于对照，且以T3处理最高，较对照增加了93.8%。

表1 不同处理土壤有机碳和速效养分Table1 Soil organic carbon and available nutrients in different treatments

图1 不同处理对脲酶活性的影响Fig. 1 Effect of different treatments on urease activity

图2 不同处理对蔗糖酶活性的影响Fig. 2 Effect of different treatments on invertase activity

2.3 不同菌肥对土壤微生物功能多样性的影响

由图3可知，随着培养时间的延长，AWCD值先迅速增加，72 h后缓慢上升。虽然各个处理微生物对碳源利用的总能力随培养时间的增加而增加，但增加的速度却不一致，培养前期以 T2增长速率最快，后期则以 T3的增长速率较快，但结果仍以T2的AWCD值最大。

图3 微生物在培养过程中AWCD的变化Fig. 3 Changes of average well color development (AWCD)of microorganism under culturing time

由表2可知，不同菌肥对土壤微生物物种的丰富度无显著影响。Simpson指数和Mcintosh指数均表现为 T2＞T3＞T1＞CK，由此可见，添加土著菌扩繁剂显著增强了微生物群落中常见物种对碳源的利用能力以及微生物群落整体对碳源的利用程度。

表2 不同处理土壤微生物功能多样性指数Table 2 Soil microbial function diversity index of different treatments

2.4 主成分分析

对土壤主要的生物、化学指标进行主成分分析，结果如表3所示。其中，第一主成分的方差占所有主成分方差的39.348%，前2个主成分的累积方差贡献率已达到67.053%，因此前2个主成分已经可以反映土壤的肥力状况。

表3 各处理土壤生态生物学性状指示公因子方差及其主成分的特征值和累积贡献率Table 3 Soil ecosystem physical and chemical indexes and eigenvalues and cumulative contribution of principle components of different treatments

因子载荷反映了主成分与生物化学指标间的相关程度，因子载荷绝对值越大，表明该指标对主成分的影响越大。图4表明，本研究PC1中微生物功能多样性指数的因子载荷绝对值均大于0.6，PC2的因子载荷绝对值在0.6以上的有4种：蔗糖酶、有机碳、速效钾和速效磷，综合分析，微生物功能多样性、蔗糖酶活性和有机碳含量为施入菌肥后变化幅度较大的土壤指标。由图4还可看出脲酶的活性与微生物的优势度和均匀度呈显著正相关关系，蔗糖酶的活性与有机碳含量呈现正相关关系。

2.5 不同菌肥对土壤呼吸速率的影响

土壤呼吸是指通过根呼吸、土壤中动物呼吸以及微生物对凋落物和土壤有机质分解释放CO2的生态系统过程。由图5可知，不同处理烟株旺长期土壤呼吸速率表现为 T2＞T3＞T1＞CK，且各处理间差异达到显著水平。

3 讨 论

土壤有机碳是土壤碳库重要的组成部分，其含量是反映土壤质量的重要因素[11]。本研究结果表明，配施菌肥可以显著提高土壤有机碳的含量，这与逢焕成等[12]的研究结果相同。添加菌肥会增加绿肥的腐解程度，同时促进了烟株根系的生长，使根系分泌物增加，从而增加有机碳的含量。

胡诚[13]、陈哲等[14]研究发现，施入生物有机肥或微生物菌肥后增加了土壤中速效钾和速效磷的含量。本研究结果与前人研究结果一致，一方面菌肥中本身含有的养分增加了速效磷和速效钾的含量，另一方面施入菌肥显著增加了土壤微生物的数量和活性，促进黑麦草中有机化合物的矿化，产生烟株可利用的速效磷和速效钾。孙薇等[15]研究发现，施用菌肥后土壤中的氮含量高于未施用菌肥的土壤，而本文的研究结果与之相反，施入菌肥后碱解氮的含量反而降低，主要是由于活性较高的微生物将较多的土壤氮转化为自身体内的有机氮，降低了土壤速效氮的含量。

艾童非等[4]，刘芳等[16]研究发现，施用微生物菌剂能显著提高土壤脲酶和土壤蔗糖酶的活性。本研究也取得了同样的结果。由于配施菌肥能加速黑麦草中有机化合物的分解，提供了酶促反应的底物，从而促进了微生物的分解，而土壤酶是微生物生长代谢的产物[17]。

图4 主成分分析因子载荷图Fig. 4 Loadings of principal component analysis

图5 不同处理对土壤呼吸速率的影响Fig. 5 Effects of different treatments on soil respiration rate

土壤微生物功能多样性既代表了土壤的生物活性，又可以反映出微生物群落的生态特征[18]。张志刚等[19]研究发现，蔬菜残株配施生物菌肥可显著提高微生物对碳源的利用能力，本研究结果同样表明，施入菌肥使土壤微生物对碳源的利用能力增强。一方面由于菌肥本身含有的微生物增加了土壤中微生物的数量和活性，另一方面菌肥的施入带入了有机质和养分，并且加速了黑麦草中有机化合物的矿化分解，增加了土壤中的养分含量，使微生物在养分丰富的条件下生长迅速。由Simpson 指数可知，配施菌肥增加了土壤中常见微生物物种的丰富度；由 Mcintosh 指数可知，配施菌肥增加了土壤中微生物群落的均匀度。

武欣等[20]研究结果显示，有机肥配施菌肥可显著提高土壤呼吸速率，本研究也取得了同样的结果。施入菌肥后增加了微生物的数量，使微生物氧化有机物的能力增强，同时微生物活动也可缓解土壤板结程度，促进根系发育，根系呼吸能力增强，有机质含量的显著提高也是增大土壤呼吸速率的重要因素。配施土著菌扩繁剂的处理，不是单纯向土壤施入微生物菌体，而是与肥料结合形成有益微生物的培养基，减弱了土壤微生态环境和土著微生物竞争对外施微生物的不利影响，使外施和土著微生物均得以充分繁殖生长，从而提高了土壤有机质和速效磷、钾的含量，增强了土壤酶活性，改善了植烟土壤微生物功能多样性，对植烟土壤质量的提高有着积极的作用。

4 结 论

本研究结果表明，配施不同菌肥显著增加了土壤有机碳和速效养分的含量，提高了土壤脲酶和蔗糖酶的活性，对土壤微生物功能多样性以及土壤呼吸速率的提高有明显的效果。其中以配施土著菌扩繁剂对植烟土壤养分以及生物性质提升效果最为明显。

[1] 李云，孙波，李忠佩，等. 不同气候条件对旱地红壤微生物群落代谢特征的长期影响[J]. 土壤，2011，43（1）：60-66.LI Y, SUN B, LI Z P, et al. Long-term effects of different climatic conditions on microbial metabolic properties in red Soil[J]. Soils, 2011, 43(1)∶ 60-66.

[2] 杨玉新，王纯立，谢志刚，等. 微生物肥对土壤微生物种群数量的影响[J]. 新疆农业科学，2008，45（S1）：169-171.YANG Y X, WANG C L, XIE Z G, et al. The influence of the microbial fertilizer on microbial population density in soil[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2008, 45(S1)∶169-171.

[3] 周莉华，李维烔，倪水珍. 长期施用EM生物有机肥对冬小麦生产的影响[J]. 农业工程学报，2005，21（S1）：221-224.ZHOU L H, LI W J, NI S Z. Effects of long-term application of EM biological-organic fertilizer on winter wheat production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2005, 21(S1)∶ 221-224.

[4] 艾童非，杨鹏九，费洪波，等. 微生物菌剂有机肥对植烟土壤环境及烤烟产质量的影响[J]. 安徽农业科学，2016，44（18）：99-102，119.AI T F, YANG P J, FEI H B, et al. Effect of applying microbial inoculum organic fertilizer on tobacco growing soil environment and yield, quality of flue-cured tobacco[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2016,44(18)∶ 99-102,119.

[5] 李娇，刘国顺，高琴，等. 不同生物有机肥与烟草专用复合肥配施对烤烟根际土壤微生物及土壤酶活性的影响[J]. 河南农业大学学报，2013，47（2）：132-137.LI J, LIU G S, GAO Q, et al. Effect of application of different bio-organic fertilizer with tobacco specific chemical fertilizer on the amount of microbe and enzyme activities in the rhizosphere soil of flue-cured tobacco[J].Journal of Henan Agricultural University, 2013, 47(2)∶132-137.

[6] 鲁如坤. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科技出版社，2000.LU R K. Soil agrochenistry analysis protocols[M].Beijing∶ China Agriculture Science Press, 2000.

[7] 关松荫. 土壤酶及其研究法[M]. 北京：农业出版社，1983.GUAN S Y. Soil enzyme and its research method[M].Beijing∶ Agriculture Press, 1983.

[8] 孟春，王立海，沈微. 择伐对小兴安岭地区针阔混交林土壤呼吸温度敏感性的影响[J]. 林业科学，2011，47（3）：102-106.MENG C, WANG L H, SHEN W. Effect of sensitivity of soil respiration to soil temperature in a coniferbroadleave forest in Xiaoxing'an Mountain after select cutting[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(3)∶ 102-106.

[9] Garland J L．Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on basis of patterns of community level sole-carbonsource utilization[J]. Applied Environmental Microbiology, 1991, 57∶ 2351-2359.

[10] 董立国，袁汉民，李生宝，等. 玉米免耕秸秆覆盖对土壤微生物群落功能多样性的影响[J]. 生态环境学报，2010，19（2）：444-446.DONG L G, YUAN H M, LI S B, et al. Influence on soil microbial community functional diversity for maize no-tillage with straw mulch[J]. Ecology and Environment Sciences, 2010, 19(2)∶ 444-446.

[11] 郝瑞军，李忠佩，车玉萍，等. 冻融交替对水稻土水溶性有机碳含量及有机碳矿化的影响[J]. 土壤通报，2007，38（6）：1052-1057.HAO R J, LI Z P, CHE Y P, et al. Effects of freezing and thawing cycles on the contents of WSOC and the organic carbon mineralization in paddy soil[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2007, 38(6)∶ 1052-1057.

[12] 逢焕成，李玉义，严慧峻，等. 微生物菌剂对盐碱土理化和生物性状影响的研究[J]. 农业环境科学学报，2009，28（5）：951-955.PANG H C, LI Y Y, YAN H J, et al. Effects of inoculating different microorganism agents on the improvement of salinized soil[J]. Journal of Agroenvironment Science, 2009, 28(5)∶ 951-955.

[13] 胡诚，曹志平，罗艳蕊，等. 长期施用生物有机肥对土壤肥力及微生物生物量碳的影响[J]. 中国生态农业学报，2007，15（3）：48-52.HU C, CAO Z P, LUO Y R, et al. Effect of long-term application of microorganismic compost or vermicompost on soil fertility and microbial biomass carbon[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2007, 15(3)∶ 48-52.

[14] 陈哲，赵永锋，张建嶺，等. 长期施用复合微生物肥对农田土壤速效养分的影响[J]. 现代农业科技，2014（19）：241-245.CHEN Z, ZHAO Y F, ZHANG J L, et al. Effect of long-term applying compound microbial fertilizer on soil available nutrients in farmland[J]. Modern Agricultural Sciences and Technology, 2014（19）: 241-245.

[15]孙薇，钱勋，付青霞，等. 生物有机肥对秦巴山区核桃园土壤微生物群落和酶活性的影响[J]. 植物营养与肥料学报，2013，19（5）：1224-1233.SUN W, QIAN X, FU Q X, et al. Effects of bio-organic fertilizer on soil microbial community and enzymes activities in walnut orchards of the Qinling-Bashan Region[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2013,19(5): 1224-1233.

[16]刘芳，韩丹，赵铭钦，等. 微生物菌剂配施腐殖酸钾对植烟土壤改良及烤烟经济效益的影响[J]. 浙江农业学报，2017，29（7）：1064-1069.LIU F, HAN D, ZHAO M Q, et al. Effects of application of microbial agents along with humic acid potassium on tobacco-planted soil and economic benefit of flue-cured tobacco[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2017, 29(7):1064-1069.

[17]翟修彩，刘明，李钟佩，等. 不同添加剂处理秸秆腐解物对红壤性质的影响[J]. 土壤，2013，45（5）：868-874.ZHAI X C, LIU M, LI Z P, et al. Effects of different additives promoted straw decomposition on red soil property[J]. Soils, 2013, 45(5): 868-874.

[18]栗方亮，李忠佩，刘明，等. 肥际氮素浓度下添加不同碳源对水稻土微生物特性的影响[J]. 土壤学报，2012，49（5）：971-978.LI F L, LI Z P, LIU M, et al. Effects of addition of carbon on microbial properties as affected by source of carbon and N concentration at fertisphere in paddy soil[J]. Acta Pedologica Sinica, 2012, 49(5): 971-978.

[19]张志刚，董春娟，高苹，等. 蔬菜残株、生物菌肥施用下日光温室辣椒土壤微生物学特征[J]. 植物营养与肥料学报，2011，17（3）：710-717.ZHANG Z G, DONG C J, GAO P, et al. Soil microbiologic characteristics under vegetable residues and bacterial manure application in greenhouse[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(3): 710-717.

[20]武欣，孟会生，栗丽，等. 不同肥料配施对复垦土壤呼吸及微生物量碳氮的影响[J]. 山西农业大学学报（自然科学版），2017，37（1）：48-53.WU X, MENG H S, LI L, et al. Effect of soil respiration and microbial biomass CN of reclamation soil with application of three fertilizers in the collapse mining area[J]. Journal of Shanxi Agricultural University(Natural Science Edition), 2017, 37(1): 48-53.