重组人白细胞介素-2的原核可溶表达

李冠英， 李海红， 徐士勋， 潘晓雨

(上海华新生物高技术有限公司，上海 201206)

白细胞介素-2(Interleukine-2，IL-2)，是由白细胞分泌的一种糖蛋白，可介导细胞间的相互作用，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用[1]。IL-2是机体免疫调节网络中的核心物质，与其他细胞因子有协同和拮抗作用，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用[2]；IL-2能刺激NK细胞、CTL、LAK细胞的活化和增殖，也能促使T淋巴细胞、NK细胞产生干扰素、肿瘤坏死因子等[3]。所以IL-2作为一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等治疗中被广泛应用[4]。目前，IL-2在临床上已被广泛应用于肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病的治疗，并取得了显著的效果，如临床乙肝、肾癌及黑色素瘤的治疗[5-8]。IL-2的广泛临床应用带来的效益，使不少样品生产厂家纷纷进入这一领域[9-10]。为获得重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)，普遍使用的策略是构建重组质粒，在大肠杆菌中表达rhIL-2。

rhIL-2以大肠杆菌作为宿主表达虽然取得了很大成功，但是其表达形式为包涵体，获得具有生物活性的rhIL-2，需要后续变性、复性等复杂的一系列步骤[11]；而rhIL-2的变复性效率极低，这就成了工业化生产的一个瓶颈，严重限制了工业化的大规模生产。使用可溶表达策略，直接表达可溶性的rhIL-2成了现阶段的一种诉求。

麦芽糖结合蛋白(maletose-binding protein，MBP)，是E.coli中主要负责麦芽糖摄取和分解的蛋白质[12]；现有研究表明MBP与外源蛋白融合时，具有强烈的助溶作用，可以显著提高与之融合的外源蛋白的可溶表达[13-14]。

本研究小组利用基因重组技术将rhIL-2融合在MBP的C端，构建pMAL-c2x-rhIL2表达载体；通过 BL21(DE3)宿主菌进行表达最终经过分离纯化及裂解得到可溶性的rhIL-2。

1 材料与方法

1.1 材料

il-2由南京金斯瑞生物科技公司合成；菌种DH5α、BL21(DE3)均由江苏大学谭小力教授惠赠；载体pMAL-c2X购于NEB(New England Biolabs)公司，DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司。DNA连接试剂盒、IPTG、DNA marker 均购于大连宝生物工程有限公司等；限制性内切酶、Amylose树脂、Factor Xa蛋白酶购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根据il-2序列设计特异性引物， 交于上海生工生物合成；序列如下:上游引物rhIL2-F:5′CATATGGCACCTACTTCAAGTTC 3′(下划线部分为NdeI位点)；下游引物rhIL2-R: 5′ GGATCCCCCCTGATATGTTTTAA 3′(下划线部分为BamH I位点)。

1.2.2 目的基因的扩增与纯化

反应体系：模板0.2 μL；引物rhIL2-F,rhIL2-R (10 μmol/L)各2.5 μL；ExTaq(5 U/μL) 0.2 μL；dNTP mixture(各2.5 mmol/L)5 μL；10×PCR Buffer 5 μL，加ddH2O至50 μL；扩增反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性45 s，56.0℃退火45 s，72℃延伸50 s，共36个循环；72℃终末延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳，将目的条带进行割胶，用DNA回收试剂盒回收纯化。

1.2.3 克隆载体rhIL2-T的构建与鉴定

PCR回收产物进行TA克隆(步骤按照 pMD19T 载体说明书)，并转化DH5α感受态，于含有0.1 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上涂布，挑选单菌落，进行PCR鉴定，将阳性克隆送上海生工生物进行测序。

1.2.4 表达载体rhIL2-pMAL-c5x的构建与鉴定

测序正确的rhIL2-T阳性克隆，提取质粒并和表达载体分别进行双酶切，50 μL体系如下:BamH I 1.0 μL、NdeI 1.0 μL，10×Cutsmart Buffer 5 μL，质粒10 μL，加ddH2O至50 μL。双酶切产物PCR产物用1%的琼脂糖电泳，将目的条带进行割胶，用DNA回收试剂盒回收纯化，DNA连接试剂盒16℃过夜连接。连接产物转化感受态BL21(DE3)，挑选单菌落，进行PCR鉴定，将阳性克隆送上海生工生物进行测序。

1.2.5 重组子的诱导表达及定位分析

将测序正确的转化子，于液体LB中过夜活化，1∶100(V/V)接种于50 mL 2×YT液体培养基中(含0.1 mg/mL氨苄青霉素)，37℃摇床培养至OD600=0.5～0.8;加入诱导剂IPTG,使其终浓度为1 mmol/L；分别于不同条件下培养(A: 37℃摇床培养4 h; B： 25℃摇床培养6 h)；离心收集菌体，弃上清，菌体用ddH2O洗涤2次，-20℃保存备用。

将诱导后收集的菌体，悬浮于20 mL 平衡Buffer(0.1mol/L NaCl,2 mmol/L CaCl2,20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)中；样品置于冰上，超声破碎仪中破碎，条件为工作5 s,停止10 s,共30 min;镜检90% 以上细胞破碎；破碎后样品，取50 μL留样作为总蛋白SDS-PAGE检测；剩余样品12 000 r/min,30 min；取出上清，作为可溶蛋白， SDS-PAGE检测；沉淀悬浮于20 mL(等体积) 20 mmol/L PB(pH 7.0)中，作为不可溶蛋白， SDS-PAGE检测。

1.2.6 融合蛋白的纯化及裂解

将2 mL Amylose树脂装于重力流柱管中，5体积ddH2O洗涤，5体积平衡Buffer平衡柱，将细胞破碎后的上清上柱，5体积平衡Buffer洗柱，用15 mL含50 mmol/L麦芽糖的平衡Buffer洗脱并收集洗脱液(每1 mL收集1管，连续收集) ；洗涤柱并保存于20%的乙醇。

将纯化后的MBP-rhIL2，按1∶50(W/W)加入Factor Xa蛋白酶，23℃孵育6 h进行裂解，SDS-PAGE检测。

1.2.7 生物学活性分析

IL-2依赖性细胞株CTLL-2在不同的IL-2浓度下，表现出生长、死亡等不同的生长状态，另外活细胞可将MTT摄入，并在线粒体中琥珀酸脱氢酶的作用下，将黄色的MTT分解成一种蓝紫色结晶——甲瓒，甲瓒溶解后在570 nm处有最大光吸收。在一定的浓度范围内，IL-2的浓度与吸光值呈线性关系，根据在不同IL-2的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同，以此检测IL-2的生物学活性。根据2015版《中国药典》第三部，“重组人白介素-2生物学活性测定法”一节，测定rhIL-2生物学活性。

实验过程：CTLL-2细胞用完全培养液(1 mL成分：胎牛血清0.1 mL，RPMI1640培养液0.9 mL,400 U IL2)于37℃，5% CO2条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每l mL含6.0×105个细胞的细胞悬液，37℃，5% CO2条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50 μL，于37℃、5% CO2条件下培养18～24 h；然后每孔20 μL加入MTT溶液，于37℃，5% CO2条件下培养4～6 h；每孔加人裂解液15 μL，于37℃，5% CO2条件下保温18～24 h。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630 nm为参比波长，在波长570 nm处测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：

待测品生物学活性(IU/mL)=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

式中：Pr为标准品生物学活性，IU/mL；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 密码子优化与载体构建

2.1.1 密码子优化

il-2序列是基于GenBank(LOCUS：NM_000586)，去掉信号肽序列，在保证氨基酸序列不变的情况下，考虑mRNA二级结构自由能及稳定性、影响表达的基序等，替换并使用E.coli中偏爱密码子优化基因序列(图1)然后进行全基因合成。

图1 rhIL-2基因序列优化前后对比

2.1.2 目的基因的扩增

以含优化后il-2的质粒为模板，rhIL2-F和rhIL2-R 为引物，进行 PCR扩增。结果如图2，在450 bp 左右有一条带，大小与预计相符。

图2 rhIL-2 基因 PCR扩增

M: DL5000 DNA Marker；1,2：rhIL-2 基因

2.1.3 克隆载体rhIL2-T的构建与鉴定

以rhIL2-F和rhIL2-R 为引物，挑取平板上单菌落为模板，进行PCR鉴定，产物经1% 琼脂糖电泳，可见在450 bp处有明显条带，表明il-2已成功连接到 T 载体(图3) 。

2.1.4 表达载体rhIL2-pMAL-c5X的构建与鉴定

以rhIL2-F和rhIL2-R 为引物，挑取平板上单菌落为模板，以rhIL2-T质粒为阳性对照，以不加任何模板为阴性对照，进行PCR鉴定，产物经1%琼脂糖电泳，可见在450 bp处有明显条带，阴性对照无任何条带，表明il-2已成功连接到pMAL-c5X载体(图4)。

2.2 MBP-rhIL2诱导表达及定位分析

rhIL2-pMAL-c5X BL21(DE3)转化子分别在37℃、4 h和25℃、6 h条件下添加1 mmol/L IPTG诱导，菌体超声破碎后进行SDS-PAGE检测。结果(图5)显示，37℃诱导后，有20%的MBP-rhIL2表达且为可溶，在56 ku处与预期大小一致。而在25℃条件下诱导，仅有少量目的蛋白表达。可见，37℃是MBP-rhIL2的较佳表达温度。

图3 rhIL2-T转化子Pcr鉴定

M: DL5000 DNA Marker；-：阴性对照；1～4：rhIL2-T转化子鉴定

图4 rhIL2-pMAL-c5X转化子PCR鉴定

M: DL5000 DNA Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；1～5：rhIL2-pMAL-c5X转化子鉴定

图5 MBP-rhIL2诱导表达及定位分析

M：蛋白marker；CK：未诱导对照；T：诱导后总蛋白；S：诱导后可溶蛋白；I：诱导后不溶蛋白。图中箭头所指处为MBP-rhIL2融合蛋白

2.3 MBP-rhIL2的纯化及裂解

将诱导后的可溶蛋白，缓慢流过Amylose树脂柱，通过MBP与树脂结合，分离MBP-rhIL2。结果如图6所示，Amylose树脂能有效地纯化MBP-rhIL2。

将纯化后的蛋白混合，利用Factor Xa蛋白酶将MBP-rhIL2经过23℃，6 h孵育后， rhIL2完全被释放，如图7所示。

图6 MBP-rhIL2纯化后SDS-PAGE分析

图7 MBP-rhIL2 裂解分析

2.4 rhIL2生物学活性分析

采用IL-2依赖型细胞株CTLL-2，以标准品IL-2为对照，对裂解后的rhIL-2进行了生物学活性测定。结果显示，重组rhIL-2和标准品IL-2一样，可以有效刺激CTLL-2细胞的增殖(图8)，说明本研究表达并纯化到的rhIL-2具有生物学活性。另外根据分子量可知rhIL-2占融合蛋白的27%，经计算裂解后的rhIL-2比活性为4.4×106IU/mg。

3 结论

本研究构建了表达载体rhIL2-pMAL-c5x，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃，1mol/L IPTG条件下经诱导后，融合蛋白有20%的表达量，且为可溶性表达；通过Amylose树脂，融合蛋白能够很便利地被纯化出来；进一步利用Factor Xa蛋白酶进行裂解融合蛋白， rhIL-2能够成功释放，并具有4.4×106IU/mg的比活性。本研究为rhIL-2在大肠杆菌中的可溶性表达及工业放大生产提供了依据。

图8 rhIL2生物学活性测定

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