Clusterin的产生机制、结构及功能

董乔梅， 赵 丽， 滕永军

(兰州大学第一医院中心实验室， 兰州 730000)

1983年Blaschuk等首次在山羊精液中分离得到一种热稳定、对胰岛素敏感、促进细胞间黏附的糖蛋白，将其命名为clusterin(CLU)[1]，并且发现该蛋白的分子质量80 ku，等电点为3.6，还原条件下在凝胶中呈现40 ku的条带。1984年，CLU具有不同等电点的蛋白形式被分离了出来[2]。通过Western blot检测CLU在小鼠前列腺中的表达时发现，其可以呈现具有不同分子质量的条带。当切除小鼠的前列腺抑制雄性激素分泌使得clusterin诱导表达时，CLU的蛋白表达谱会变得更加复杂[3]。这一结果进一步证实了CLU是一种具有多种蛋白形式复杂难以研究的蛋白。CLU的功能多样，参与细胞内外重要的生命活动。CLU功能的多样性与其复杂的结构密切相关。本文就clusterin不同蛋白产物的结构、定位、产生机制、具有的功能以及参与的信号通路做一综述。

1 clusterin的结构及蛋白产生机制

图 1 sCLU及nCLU的剪切加工机制[6]Fig 1 The processing mechanism of sCLU and nCLU

编码CLU的基因位于8p21，全长为1.9 kb，其有9个外显子和8个内含子。这个单拷贝的基因可以编码不同的蛋白产物，具有不同的细胞定位，发挥不同的生物学功能，主要是分泌型(sCLU)及核型(nCLU)。目前了解比较清楚的是sCLU，在这里sCLU被定义为经过完全加工和剪切，成熟并可以分泌到细胞外发挥功能的糖蛋白。在其加工成熟的过程中，首先从第一个AUG密码子(由第2个外显子编码)翻译形成包含449个氨基酸的前体蛋白，位于胞浆，分子质量为60 ku。其前21个氨基酸组成了分泌信号序列，指导蛋白进入内质网，发生糖基化，然后进入高尔基体，在Arg205和Ser206间发生断裂，形成α链和β链，通过5个二硫键相连。这样就形成了成熟的分泌型CLU(sCLU)。在不同种属以及同一种属不同的组织中，CLU的糖基化修饰会发生一定程度的变异，经完全糖基化修饰成熟的蛋白其分子质量在75～80 ku之间(未发生切割)。这种蛋白在物种间相对保守，在一定的刺激信号下可以分泌到细胞外间隙和体液中发挥一定的功能[4-5]。对nCLU的加工成熟机制，目前主要有两种观点，选择性剪切加工机制及选择性转录起始位点加工机制。选择性剪切加工机制认为，nCLU是clusterin全长基因经过选择性剪切形成的。当clusterin的第2个外显子发生选择性的剪切，第1个外显子和第3个外显子(编码第2个AUG密码子)发生拼接后，从第2个AUG密码子翻译形成分子质量为49 ku的蛋白，其不具有内质网导肽，不能指导蛋白进入内置网发生糖基化以及α链和β链的断裂，但是具有至少两个核定位信号，可以由胞浆转运至核，转变为核型(nCLU)，发挥一定的生理功能[6](见图1)。选择性转录起始位点加工机制认为，nCLU是由全长mRNA的第2个AUG密码子(位于第3个外显子上)起始翻译形成的，但是在加工过程中并不发生第2个外显子的选择性剪切。然而，选择性的转录起始位点理论和选择性的剪切加工机制一样，都不能解释nCLU为何能在如此短的时间内产生。至此，科学家们又提出了一种选择性的启动子理论，认为CLU的不同蛋白产物可能是由于它们分别活化不同的启动子，导致具有不同N端结构域的蛋白产物合成，而这一结构域决定了蛋白在细胞中的定位，从而决定了蛋白在细胞中功能的发挥。因此，科学家们预测，在不同的实验条件，不同的细胞类型及组织环境中检测CLU基因不同启动子区域的活化，可能具有一定的意义[7]。然而在目前还缺乏实验证据的情况下，许多研究者们认为，与其说nCLU是一种异构体，不如说nCLU是一种细胞核中的存在状态。我们对sCLU的结构已有了粗略的了解，但是依然不知道nCLU的真实面目，甚至有学者怀疑nCLU的存在可能是实验中产生的假象。通过免疫荧光或是激光共聚焦扫描显微镜检测CLU在完整地经过固定的细胞中的定位将对其定位了解非常重要[8]。

2 CLU的功能

CLU具有多种功能，甚至在相互对立的方面均发挥重要的作用，例如细胞的增殖、凋亡。虽然CLU的发现已有20多年的历史，但是对它在细胞增殖凋亡中发挥的作用目前还不是非常清楚。最初的研究发现CLU与凋亡相关。Leger等[9]通过原位杂交发现，在小鼠退行性前列腺凋亡的上皮细胞中CLU高表达；随后许多科学家发现，在发生凋亡的多种器官组织中(包括心、脑、肺、肝、肾和视网膜等)，均存在CLU的高表达。CLU的上调表达似乎可以成为细胞发生凋亡的标志。然而，后续的研究发现，CLU具有抗凋亡作用，在包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌在内的多种肿瘤中高表达，并且其高表达与肿瘤的侵袭转移以及不良预后密切相关[10-11]。CLU到底在肿瘤中高表达还是低表达，到底是诱导细胞凋亡还是促进细胞增殖存在争议，甚至在同一种肿瘤的研究中都会出现相反的结果。出现这些矛盾的结果可以有多种可能的解释：由于CLU存在多种细胞组分中，具有多种存在形式，不同类型又具有不同的定位，发挥不同的功能。运用针对CLU不同表位的抗体，靶向CLU不同异构体的引物合成出的PCR产物，这些不同都会导致最终结果的差异，甚至出现截然相反的结果。此外对同一结果的不同解读也可能是导致偏差，出现矛盾结果的其中一个原因。目前一般的看法是，分泌型clusterin(sCLU)在不同遗传背景的肿瘤细胞中起着抗凋亡的作用，而核型clusterin(nCLU)诱导细胞凋亡。并且两者的动态平衡在细胞的生命活动中扮演重要的角色。

2.1 分泌型CLU与细胞增殖、凋亡

由clusterin全长mRNA翻译，经糖基化修饰，具有α链和β链的sCLU，其表达发生变化与多种恶性肿瘤的发展密切相关。Saffer等[12]用特异性识别sCLU的抗体，通过免疫组化检测到82%的淋巴瘤中sCLU表达升高，可能作为生物标志物用于淋巴瘤的诊断。此外，研究发现sCLU的高表达还会导致机体对放疗以及紫杉醇、阿霉素、顺铂等化疗药物产生抗性。在肿瘤细胞中，sCLU促进细胞增殖、抑制凋亡、对化疗药物产生抗性作用的发挥是通过与受体结合，活化多种信号通路来实现的。例如sCLU通过与其受体maglin的结合，促进AKT的磷酸化，进而诱导Bad蛋白发生磷酸化，阻止细胞色素c从线粒体中向胞浆中的释放，抑制细胞发生凋亡[13]。sCLU与受体的结合同样可以促进MEK/ERK信号通路活化，而该通路的活化可以促进细胞增殖[14]。Zoubeidi等[15]的研究发现在前列腺癌中sCLU的高表达可以促进IKB的降解，释放NF-κB入核发挥转录因子的作用，从而促进细胞增殖。研究发现，sCLU通过与活化的Bax的相互作用来抑制凋亡[16](见图2)。

尽管如此，分泌型CLU的表达上调是否是肿瘤发生的共同特征，可以保护肿瘤细胞免于凋亡，仍然存在争议。因为也有文献报道指出，分泌型CLU在包括胰腺癌、前列腺癌、食管癌、成神经细胞瘤、结肠直肠癌在内的多种肿瘤中低表达[17-18]，对其原因还不是非常清楚。一种可能的解释就是在癌变过程中发生染色体、基因、蛋白的异常改变。在结肠直肠癌中经常出现clusterin所在八号染色体短臂的缺失，这似乎可以解释其低表达的原因。

2.2 核型CLU与细胞增殖、凋亡

nCLU被定义为细胞核中的一种存在形式，是通过一定的方法在完整的细胞核中检测到的clusterin蛋白，即使是微量的存在也将其定义为nCLU[11]。最早是1996年由Reddy等[19]提出的，他们的研究发现，TGFβ可以诱导细胞中的CLU进入细胞核。此后的研究发现，多种刺激因子，如电离辐射、化疗药物、激素、细胞因子、热休克或是细胞缺钙的作用下均可以诱导细胞核中CLU蛋白的表达。2003年之后，许多文献开始报道nCLU可能具有的功能，发现该蛋白可能抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。Moretti等[20]的研究发现，当CLU在细胞核内的表达量升高时可以抑制细胞发生增殖和迁移。Leskov等[21]对乳腺癌细胞系MCF-7的研究中发现，在电离辐射的作用下，CLU由胞浆转运至核，促进细胞凋亡。Scaltriti等[22]的研究发现，在前列腺癌细胞中细胞核内CLU的高表达可以引起G2-M期的停滞，从而诱导细胞经caspase倚赖的途径发生凋亡。目前认为nCLU促凋亡功能的发挥是通过在细胞核中与ku70蛋白作用实现的，nCLU与ku70的结合，抑制ku70蛋白发挥DNA损伤修复的功能，最终抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡[16](见图2)。

当然，由于不同的肿瘤存在异质性，nCLU抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡的结论也不是绝对的。我们实验室在对食管癌的研究中发现nCLU在肿瘤组织及细胞系中高表达，对其可能的机制正在进一步的研究中。

图2 sCLU及nCLU参与的信号网络[16]

3 小结

虽然CLU发现至今已有20多年时间，关于该蛋白的文献报道已有上千篇，但是对CLU的认识依然令人迷惑不解。CLU蛋白还没有得到分离、纯化和结晶，目前得到的CLU蛋白的结构只是通过计算机模拟出来的；clusterin单一拷贝的基因可以编码多种蛋白产物，但是这些蛋白产物的产生机制还没有得到充分的揭示；CLU蛋白参与许多重要的生命活动，这些功能的发挥与该蛋白在细胞中的不同定位密切相关，而在这方面目前也缺乏全面的认识。因此，对不同类型的CLU蛋白结构的认识，产生机制的阐明，表达调控机制的了解非常重要。CLU不同蛋白类型之间的动态平衡到底在不同类型的肿瘤中发挥怎样的作用，是否可以用于肿瘤的诊断，预后以及作为治疗的靶标都有待进一步的研究。

致谢：感谢中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院赵晓航研究员在本文写作中给予的帮助。

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