冷驯化下中缅树鼩脂肪细胞的流式分析
2018-03-08朱万龙侯东敏孙舒然王政昆
朱万龙, 侯东敏, 孙舒然, 王政昆
(云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室 云南师范大学 生命科学学院, 昆明 650500)
白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)被广泛认为储存脂肪,而褐色脂肪组织高水平表达产热基因,通过产热可以抑制体重增加和多种新陈代谢疾病[1-6]。米色脂肪细胞,由于冷刺激或其他各种活化剂诱导产生于白色脂肪组织中[7]。最近的研究发现,在小鼠中激活褐色和米色脂肪细胞活性,能够有效减少包括肥胖在内的代谢疾病[8]。对越来越多的调控褐色和米色脂肪细胞基因通路的识别,可为新陈代谢疾病提供了多种治疗途径[9-10]。
流式细胞术自20世纪60年代开始发展起来,主要应用于生物医学的基础研究,例如细胞生物学、免疫学和分子生物学,是细胞与分子生物学、单克隆抗体技术、生物技术、荧光化学、激光技术、光电子物理、流体力学、计算机技术等多学科领域共同发展的结晶[11-12]。它不仅能够快速定量分析细胞群的物理化学特征,还能通过这些特征精确分选细胞,主要分为流式细胞分析和流式细胞分选两部分[13]。20世纪80年代后期开始应用于临床,并通过对外周血CD4+T细胞的检测来监测HIV患者疾病的进展,开启了用于临床医学的新纪元。现在,流式细胞术不仅能够辅助多种疾病的判断,还为生物学发展提供了新技术[14-16]。
流式细胞术自发展以来多应用于免疫学、肿瘤学、血液、细胞凋亡、细菌学,而实验动物也多为小鼠等啮齿类动物。对于脂肪细胞的研究也多数集中于前体脂肪细胞的分化机制及特异性分子标记物,而缺少流式细胞术对于成熟脂肪细胞的分析、分选[17]。脂肪组织中的褐色脂肪组织,其产热的机制是通过线粒体内膜上的解偶联蛋白-1(UCP1)将脂肪酸氧化与ATP产生解偶联,把能量直接以热量的形式散失而不生成ATP,即通过解偶联作用消耗脂肪产生的热量。因此褐色脂肪是消耗能量的组织,激活褐色脂肪可增加能量支出,具有潜在抵抗肥胖的作用,从而备受关注。随着研究不断深入,发现在冷刺激下,白色脂肪组织中会产生一种“brown-like”米色脂肪细胞,这一变化称为白色脂肪组织的“褐变”,这种细胞富含线粒体,且表达BAT特有产热基因——UCP1[18]。中缅树鼩属于攀鼩目树鼩科动物,主要分布于南亚和东南亚,为东洋界特有的小型哺乳动物,由于其与灵长类动物亲缘关系较近,它的新陈代谢系统和解剖结构远比犬、鼠等更接近于人类,且作为模式动物成本低,广泛用于神经、内分泌、病毒等方面的研究,具有十分广泛的开发应用前景,所以,以树鼩为实验动物,在生物医学上可以作为人类代谢疾病的良好动物模型[19]。本研究以中缅树鼩为实验动物,首次利用流式细胞术对冷驯化下树鼩脂肪细胞进行了分析、对比,研究是否在冷驯化条件下中缅树鼩的WAT中会产生米色脂肪组织,为以树鼩的基础生理学提供数据。
1 材料与方法
1.1 样本采集
1.2 流式细胞样品的制备
1)动物断颈处死后,分别取下树鼩肩胛、耳后、腋下褐色脂肪组织,与腹部大网膜、腹股沟白色脂肪组织后泡在PBS中,将组织上附着的毛洗掉。
2)将组织置于2 mL的EP管中,加1 mL 0.25%不含EDTA的胰酶,用平剪将组织剪碎,约1 mm3大小,将剪碎的组织块转移至15 mL离心管中,胰酶补至4 mL,放入37℃水浴锅中温浴,每隔10 min摇晃1次,显微镜下观察组织块消化成单细胞的程度,共约1 h。观察样品是否黏稠,若样品较为黏稠,1000 r/min离心10 min仍不能离下沉淀,则补PBS至10 mL离心,1500 r/min 10 min,弃上清。
3)沉淀用10 mL PBS重悬一下,将大的组织块剔除,离心1000 r/min,10 min,弃上清,留少量PBS将松散的沉淀吹散,吸出至新的2 mL离心管中,血细胞经过离心后贴壁较牢,因此可将血细胞剔除。重复用PBS洗1次。
4)4%预冷的多聚甲醛将细胞重悬,4℃固定过夜。
5) 固定过夜的细胞用移液枪重悬起来,剔除大的组织块,离心1000 r/min,10 min,4℃,弃上清。
6) 沉淀用1 mL PBS重悬,离心, 1000 r/min,10 min,4℃,弃上清留沉淀。
7)加1 mL的含0.1%的Tween细胞打孔剂将细胞重悬,打孔30 min。
8)离心800 r/min,10 min,弃上清。用PBS洗一遍细胞。加50~100 μL的PBS混匀细胞,加入适量的UCP1一抗,室温孵育40 min。
9)加PBS至1 mL混匀,离心800 r/min,10 min,加PBS洗1遍。
10)按1∶2000的比例加入二抗,避光,室温孵育40 min。PBS洗1遍,加PBS至1 mL,准备上机[20]。
1.3 数据处理
白色脂肪组织和褐色脂肪组织中UCP1抗体阳性标记均以百分数表示,由流式细胞仪读数。
2 结果
2.1 脂肪细胞样品制备技术探讨
为顺利制备中缅树鼩脂肪细胞流式样品,实验前选择冷驯化中缅树鼩为材料,选用具有UCP1表达的褐色脂肪细胞进行样本分析,并选取70%酒精和4%多聚甲醛2种固定剂,0.1%Triton-100、0.05%Tween等2种打孔剂进行组合探讨最佳方案。其中利用70%酒精进行固定后,再用0.1%Triton-100或0.05%Tween进行打孔后,染色效果不好(图1)。而利用4%多聚甲醛进行固定后,再用0.05%Tween进行打孔发现,其染色效果较好,约有70.40%的细胞被染色,可以选定利用4%多聚甲醛进行固定,0.05%Tween进行打孔,制作中缅树鼩脂肪细胞流式样本(图2)。
图1 70%酒精固定对细胞散射光的影响
A: 0.1%Triton -100 ; B:0.05%Tween
图2 4%多聚甲醛固定对细胞散射光的影响
A: 0.1%Triton -100通透;B:0.05%Tween通透
2.2 白色脂肪细胞的流式分析
对照组中缅树鼩腹部大网膜、腹股沟等“典型”WAT显示出单一的R1群,且没有UCP1表达(图 3)。冷驯化4周后,中缅树鼩腹部大网膜、腹股沟等“典型”WAT显示出单一的R1群, 用UCP1抗体标记后,有5.70%的细胞显示为阳性,冷驯化使WAT中出现UCP1表达阳性的细胞群(图 4)。冷驯化7周后,树鼩腹部大网膜、腹股沟“典型”WAT中出现了新的细胞群R2群。其中R1群用UCP1抗体标记后,有69.64%的细胞显示为阳性。冷驯化使WAT R1中出现UCP1表达阳性的细胞群。冷驯化新生成的R2群用UCP1抗体标记后,有95.28%的细胞显示为阳性,冷驯化使WAT中出现UCP1表达阳性的细胞群(图 5)。
2.3 褐色脂肪细胞的流式分析
冷驯化7周后,树鼩肩胛、耳后、腋下BAT中R1群用UCP1抗体标记后,有67.82%的细胞显示为阳性。R2群用UCP1抗体标记后,有94.99%的细胞显示为阳性。这说明冷驯化增加了树鼩BAT中UCP1的表达,BAT产热活性增强(图 6)。
图3 冷驯化0 d中缅树鼩WAT流式分析图
图4 冷驯化28 d中缅树鼩WAT流式分析图
图5 冷驯化49 d中缅树鼩WAT流式分析图
图6 冷驯化49d中缅树鼩BAT流式分析图
Fig 6 The flow cytometric analysis diagram of BAT during 49d cold acclimation inT.belangeri
3 讨论
本实验首次成功探索出了利用中缅树鼩脂肪组织流式样品的制作方法,首次利用流式细胞术对冷驯化下中缅树鼩脂肪细胞进行对比分析。研究结果显示:冷驯化28 d时中缅树鼩腹部大网膜、腹股沟等“典型”WAT的单一R1群中有5.70%的细胞显示为UCP1阳性(图4)。至49 d时“典型”WAT中出现了新的细胞群R2群。其中R1群有69.64%的细胞显示为UCP1阳性,R2有95.28%的细胞显示为UCP1阳性。冷驯化使WAT中出现UCP1表达阳性的细胞群(图5),结合本研究组之前对于冷驯化条件下脂肪组织切片的形态学证据[21],本研究得出冷驯化确实可以诱导出米色或褐色脂肪细胞。
但目前关于如何诱导白色脂肪组织中出现米色脂肪细胞的具体机制还不清楚。许多著名学者都对这一诱导机制产生了浓厚兴趣,纷纷对此进行了研究[22-24]。Tran等对小鼠的脂肪组织进行电镜切片,对可能产生米色脂肪细胞的组织进行相关基因检测,认为米色脂肪细胞可能起源于血管内皮细胞[25]。Barbatelli等将小鼠进行冷暴露,发现冷驯化下的小鼠中的白色脂肪细胞的C/EBPα基因表达增加,而与细胞有丝分裂相关的基因则基本维持稳定水平没有改变,同时实验结合出现米色脂肪组织的超显微结构的照片得出,冷驯化可以诱导WAT中出现米色脂肪细胞[26]。而Schulz的团队则利用流式细胞仪进行研究,他们分选出的前体骨骼肌细胞(Sca-1+, CD45, Mac1),可以用药物诱导分化成米色脂肪细胞[27]。目前的研究主要指向这3种不同的发生机制,但不能排除这3种机制共同作用,若有共同作用,何种作用为主导皆有待阐明。相信以BAT 为靶点,安全有效的诱导 WAT中的米色脂肪细胞必将成为防治肥胖等代谢疾病研究的新方向[28-29]。
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