酸枣内生菌的筛选及其次级代谢产物的初步分离

邓振山, 魏婷婷, 高 飞, 刘玉珍, 苏 瑞, 陈邦凯, 莫达锐

(延安大学 生命科学学院， 延安 716000)

植物内生菌(Plant endophyte)是存在于健康植物组织和器官中，而被感染的宿主植物不表现出明显侵染症状的一类微生物。对植物内生真菌研究发现，其次生代谢产物十分丰富，尤其是药用植物内生真菌中，包括了萜类、生物碱类、苯丙素类、黄酮类、甾体类、醌类、糖类、有机酸类、脂类、肽类等多种化合物[2]，内生真菌能合成黄酮、生物碱、萜类、甾体等多种化合物，其中大多数化合物具有抗菌、抗癌、生物防治等活性[3]。因此从植物内生菌中提取次生代谢活性物质的研究活动，且已取得了较大进展。植物内生菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对寄主有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用，是植物病虫害防治，内生联合固氮菌筛选，诱导抗病性及转基因载体的天然菌源，具有较高的理论研究价值和实际应用价值，已成为微生物和植物学学科的研究热点[4]。

虽然自Bacon等[5]从黑麦草种子中分离出第一株内生真菌至今已有100多年历史，但直到20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牧畜中毒是由于食用感染内生真菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛的开展起来。Stierle等[6]从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株能产抗癌活性物质紫杉醇的内生真菌,这才引起人们对内生真菌产生抗肿瘤活性物质的极大注意。

酸枣[ZiziphusjujubaMILL. var.spinosa(Bunge)HuexH.F,Chow.]系鼠李科植物。我国北方野生酸枣资源十分丰富，主要分布在太行山区。酸枣肉中含有大量维生素C和19种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸。而且，在酸枣中检测出31中微量元素，其中9种为人体必需微量元素。近年来对酸枣活性成分的分析和药理作用进行了大量的研究工作。

1 材料与方法

1.1 材料

酸枣材料选用陕北野生酸枣，大多采自延安大学后及延安市各个县，采集酸枣侧枝，采样后立即带回实验室用清水冲洗干净。

1.1.1 供试培养基

1)固体分离培养基。①马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g；葡萄糖20 g；琼脂18 g；蒸馏水1000 mL；pH自然；0.1 MPa，121℃灭菌30 min。

②牛肉膏蛋白胨培养基(NA):牛肉膏3 g；氯化钠5 g；蛋白胨10 g；琼脂18 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.2；0.1 MPa，121℃灭菌20 min。

③高氏一号培养基:可溶性淀粉20 g；氯化钠0.5 g；硝酸钾1 g；三水合磷酸氢二钾0.5 g；七水合硫酸镁0.5 g；七水合硫酸亚铁0.01 g；琼脂18 g；水1000 mL；pH 7.5；0.1 MPa，121℃灭菌20 min。

④水琼脂培养基:琼脂18 g；蒸馏水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃灭菌20 min。

⑤改良PDA培养基：酸枣茎浸汁；琼脂18 g；马铃薯200 g；葡萄糖20 g；蒸馏水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃灭菌20 min。

⑥无机盐培养基:磷酸二氢钾2.5 g；硫酸镁0.2 g；硝酸铵3.0 g；硫酸亚铁0.1 g；磷酸氢二钾2.0 g；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL；pH 7；0.1 MPa，121℃灭菌20 min。

2)液体发酵培养基。上述1)种培养基不加琼脂。培养基需0.1 MPa；0.1 MPa，121℃；灭菌20 min。

1.1.2 供试指示菌

供试指示菌有7种，具体见表1。

表1 供试指示菌

1.2 方法

1.2.1 内生菌的分离与纯化

采用组织分离法[7]和四区划线分离法进行内生菌分离、纯化。用冲洗干净的新鲜酸枣茎，浓度为95%的酒精浸泡3 min(除去表面的蜡层)→无菌水冲3～4次→浓度为0.1%升汞浸泡4～7 min(根据茎的生长状况及采取部位而定)→无菌水冲洗4次。无菌操作，将上述处理过的材料剪切成0.5 cm的小段或者削成薄片，接种于平板培养基上(用灭过菌的镊子轻轻按一下)，每板5～6块，置于36℃±1℃恒温培养箱中培养5～7 d。当观察到组织块边缘有微生物长出后，将其接种到PDA培养基上培养，设置3个重复。通过四区划线分离法得到菌株纯培养物，斜面4℃保存[8]。

表面消毒效果检测：将最后一次冲洗组织的无菌水用灭过菌的涂布器均匀涂布于灭过菌的PDA培养基上，置于36℃±1℃培养箱中培养5～7 d，每个样设置3个重复，检查是否有微生物长出。

1.2.2 内生菌体外抑菌活性测定

将已筛出来的内生菌以及病原菌转接到牛肉膏固体培养基上扩大培养。待培养基上长满内生菌后，无菌条件下取直径为1 cm的菌块3～5个接种于灭菌的PDB培养基(250 mL三角瓶中加入100 mL液体培养基)，置于36℃±1℃恒温摇床，160 r/min振荡18～24 h。无菌条件下，用灭过菌的棉签将病原菌均匀涂满牛肉膏固体培养基上，直径10 mm 的无菌打孔器在涂满病原菌的培养基上打孔并注入内生菌发酵液。实验组设置3次重复，置于36℃±1℃恒温培养箱培养2～4 d后，观察并测量抑菌圈直径，对照组在孔中注入与实验组相同处理过的无菌水，对照组设置3次重复。

1.2.3 菌株液体发酵及产物的粗提

将菌株B-08-12，B-08-20扩大培养，无菌条件下，取直径1 cm的内生菌菌饼4～5块，分别接种于含200 mL的发酵液培养基中，接种25瓶，共发酵5 L，置于36℃±1℃、160 r/min恒温震荡培养器中5～7 d。经水浴锅将其蒸干。根据极性用等体积石油醚，乙酸乙酯，正丁醇、甲醇依次萃取[9]，浓缩后于4℃冰箱保存备用。

1.2.4 酸枣植株体有效成分提取

1)酸枣茎剪碎处理。取干净的酸枣枝条，剪成1 cm长的小段。

2)溶剂提取。取酸枣茎的短段5个，料液比为1∶16，温度100℃，加石油醚，于索式提取器中回流约2 h放冷，倾滤出溶剂，反复提取3次，合并，滤过，滤液置减压旋转蒸发器中回收溶剂，再用无水乙醇回流提取3次，每次2 h合并，浓缩并回收乙醇，得提取液，经微孔滤膜过滤浓缩，置于4℃冰箱中备用。

1.2.5 薄层层析[11](TLC)分析

1)制板。将薄层层析硅胶与0.4%羧甲基纤维素钠溶液混合(过程中可加3～4滴无水乙醇，起消泡作用)，充分研磨(朝一个方向)，倒在10 cm×5 cm玻璃板上，铺匀，轻微振荡，使液体均匀水平静置晾干，使用前105℃活化30 min。2)点样、展开。用毛细管分别吸取少量酸枣茎提取液、菌株发酵液，点于硅胶板底部，以酸枣茎提取液提取液为对照，每点重复点样几次，晾干。点样后用氯仿∶甲醇(15∶1)混合液为展开试剂。3)显色反应。碘晶体显色反应:挥干溶剂，放在盛有碘晶体的封闭容器中，完成显色，并计算其Rf值。

Rf= 展开后起始线距斑点中心的距离∕展开后起始线距溶剂前沿的距离。

1.2.6 硅胶柱色谱法

采用湿法装柱，先在层析柱内加入约10 cm高的石油醚，打开阀门使之缓慢流出。将硅胶与石油醚浸泡摇匀，放入超声清洗仪中超声30 min，取出，沿玻璃棒一次性转入层析柱内，使硅胶沉积压实。在硅胶顶端加一层滤纸片。干法上样，取上述萃取物用甲醇溶解，用80～100目的硅胶拌样，小心加到硅胶顶端，在其上面再加上一层滤纸片。选用薄层色谱的展开剂氯仿∶甲醇 (15∶1)作为洗脱剂。收集分离出的馏分，用薄层层析检测合并相同组分。

1.2.7 紫外分光光度法

吸取3 mL甲醇至比色皿中，放入UV2400的样品池中校准基线。取4中柱层析的分离物0.5 g于干燥的烧杯中→用甲醇将其溶解→然后用微孔滤膜过滤5～6次→用干燥的胶头滴管吸取至比色皿中，放入样品池中进行测定。

1.2.8 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel软件和IBM SPSS Statistics v20软件进行数据整理和统计。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性测定

采用平板对峙法对分离到的20株内生菌进行初步筛选。结果表明有3株内生菌对一种或多种病原菌具有不同程度的拮抗作用，占分离菌株总数的15%。这3株均为内生细菌，无内生真菌与放线菌。筛选出的20株内生菌形态特征见表2。其中B-08-12，B-08-20这俩株具有较强的抑菌活性，并且B-08-20还有较广谱的拮抗作用，对7种指示菌中的5种均有抗性。20株内生拮抗菌对7种病原菌的抑制效果见表3。其中，B-08-12，B-08-20抑菌现象明显(见图1)。

图1 B-08-12,B-08-20对病原菌的抑制作用

a为B-08-12,B-08-20对病原菌P-1的抑制作用；b为B-08-12,B-08-20对病原菌P-2的抑制作用；c为B-08-12,B-08-20对病原菌P-3的抑制作用；d为B-08-12,B-08-20对病原菌P-4的抑制作用

表2 20株内生细菌的形态特征

表3 20株内生菌对指示菌的抑菌活性测定结果

抑菌圈直径：“+”d≤5 mm;“++”5 mm

2.2 TLC检测结果

TLC检测结果表明：B-08-20菌株发酵液与标准酸枣茎提取液有相同的迁移率以及显色斑。由图2可知B-08-20菌株发酵液有1个褐色斑点，在Rf值为0.43与芦丁对照品斑点Rf值0.43相同。并且在254 nm紫外灯下检视观察，可看见有一褐色点。

图2 菌株B-08-20发酵液与酸枣茎提取液TLC图谱比较

L为 芦丁对照品；R为B-08-20菌株发酵液

2.3 紫外分光光度法检测结果

经紫外吸收光谱全波段扫描，样品在200～600 nm样品在203 nm处有最大吸收峰。经查文献对照黄酮类物质在200～600 nm之间有吸收峰，可以初步确定该物质为黄酮类物质。

3 讨论与结论

本实验结果表明：不同的植物中内生菌的种类和数量有一定的差别，通过抑菌试验初步筛选，从酸枣茎中分离的20株内生菌中获得3株具有较强抑菌效果的菌株，占分离菌株数的15%，其中B-08-20的抗菌谱最广，对4种不同的指示菌(1，2，3，4)均有强烈的拮抗作用。经薄层层析(TLC)分析表明，B-08-20 菌株的发酵产物可与碘蒸气发生特征性颜色反应而呈现褐色斑点，并通过紫外分光光度法进一步分析证明B-08-20菌株可能具有可发酵产生酸枣黄酮类成分的能力。

图 3 紫外吸收光谱图

纵坐标：OD值；横坐标：波长(nm)

在内生菌的筛选中，共分离出20株菌，其中17株为细菌,真菌2株，放线菌1株，细菌占了绝对优势。这可能是酸枣茎中以内生细菌为主，也可能与本实验技术、方法、条件的限制有关，未能充分筛选出酸枣茎中所有的菌株，特别是放线菌和真菌。因此在筛选植物内生菌方面还有待于对传统的筛选条件进行改进，采用更新型的筛选方法和技术，从而充分挖掘优势植物内生菌资源。

本实验通过薄层层析和紫外分光光度法证明了酸枣茎内生菌可产生与酸枣茎化学成分相似的化合物，这与药用植物内生菌具有产生与宿主活性成分相同或相似化合物的能力的相关报道是一致的。现在许多药用植物内生菌及其代谢产物的开发利用成为热点。许多学者认为内生菌能合成与宿主相类似的代谢产物是由于它们具有相类似的代谢途径，这些都为植物资源的保护提供了基础。目前已有学者从其他植物中分离出黄酮类等活性成分，但从酸枣茎分离出黄酮类物质以及产黄酮类化合物的内生菌的研究还未见报道。本实验从酸枣茎中分离出B-08-20活性菌株产黄酮类成分,这将为酸枣植株资源的有效利用奠定基础，以及为黄酮类成分的提取提供另一个参考对象。同时，由于实验过程中提取方法、展开剂、显色剂、色谱等条件的限制，本实验只对B-08-20酸枣茎内生菌的黄酮这种产物进行了初步的提取、分析，并未涉及其他产物。故仍需要利用其他生物化学手段进行提取、纯化、鉴定，从而充分挖掘该菌株次级代谢产物的多样性。

本课题旨在寻找生产黄酮类化合物等活性物质的内生菌。虽然找到了具有发酵产生黄酮类化合物能力的内生菌，但还未对其他拮抗菌株的其他活性成分，也未对这株内生细菌进行分类、鉴定、分析及其代谢产物是否具有药用活性。本课题不仅可作为新型药物的种质资源，而且有利于维持生态平衡和植物资源保护。

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