藻际芽孢杆菌对坛紫菜生理的影响

熊玉琴， 杨 锐， 杨华田， 孙晓晓

(宁波大学 海洋学院 浙江省海洋生物工程重点实验室， 宁波 315211)

藻类是海洋生态系统中重要的生产者，它们在生长过程中向环境释放大量有机质，并在特定条件下分泌维生素、酶和毒素，在藻体周围形成一种独特的微环境，被定义为“藻际微环境”(Phycosphere)[1]。细菌是海洋环境重要的分解者，通过一系列的代谢活动参与藻际微环境中多种物质的分解与转化过程，是藻类营养物质的提供者与加工者；同时细菌还通过产生或分泌对藻类有益的代谢物质或胞外物，从而促进藻类的生长[2]，影响着藻类的种类和生理状态[3]。

坛紫菜(Pyropiahaitanensis)[4]是产量最高的紫菜栽培种，具有较高的营养、药用及生态价值，已经成为最有价值的人工栽培海藻之一。近年来，由于紫菜人工栽培范围的不断扩大，工业发展以及气候变化等因素的影响，海区环境日益恶化，每年都有不同程度的紫菜病害发生。紫菜病烂是一个相当复杂的问题，许多专家从引起紫菜病烂的病原菌入手，如引起条斑紫菜丝状体黄斑病的河豚毒素交替假单胞菌[5]、条斑紫菜绿变病柠檬假交替单胞菌及坛紫菜叶状体红烂病的细菌[6-7]等。虽然发现了病害的单一致病菌，但无法确定所识别的致病菌是否为唯一的病原菌，而且无法明确同属不同种间是否表现出致病性与益生性的差异[8]。这说明藻际微生物的功能可能受到其他因素的调节，进而对藻类产生影响。因此，近期研究开始关注藻际微环境与藻类的生态关系，为探索藻类健康养殖提供了新视角。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

Zobell 2216E 海水培养基：酵母粉1 g，蛋白胨5 g，柠檬酸铁0.1 g，陈海水定容至1000 mL(pH 7.6～7.8)；营养海水：参考文献[9]的方法。

坛紫菜采集于宁波象山，自然阴干，储存于-20℃。在无菌海水中复苏24 h，挑选细长、颜色呈褐色的叶片，在无菌海水中用灭菌软毛刷清洗其表面3次，将清洗好的紫菜叶片放入0.7%KI溶液中浸泡10 min，经无菌海水清洗3遍后，抗生素处理参考文献[10]的方法。

芽孢杆菌Bacillμssp. WPySW2由本实验室提供。WPySW2接种于100 mL 2216E液体培养基中，37℃、140 r/min 下活化2～3次。稀释浓度为1×108cells/mL，低速离心去掉营养海水，无菌海水悬浮，按1∶100比例接入营养海水中。

1.2方法

1.2.1 “藻-菌”共培养与纯培养

每个平行含 0.2 g 无菌处理好的叶状体，加入到300 mL海水营养液，进行坛紫菜叶状体与芽孢杆菌(3×108cells/mL)共培养(Ph-B)，光强：50～70 μmoL·photons/m2s1，光周期(L∶D)= 12∶12，温度为20℃，培养周期3 d，充气。相同培养条件下，纯培养(Ph-C)则不添加细菌。

1.2.2 芽孢杆菌定植坛紫菜的生物特性观察

样品预处理：将培养3 d的坛紫菜取出，剪成约1～2 mm的正方形，若干片，用现配置的2.5%戊二醛固定后投射电镜观察。

1.2.3 酶活测定

SOD和POD酶液制备：取0.3 g 新鲜藻体，加入0.1 mo/L pH 7.4 PBS 缓冲液，制备成10%匀浆液，然后在4℃下4000 r/min离心10 min，上清即用于酶活力测定。SOD和POD、使用试剂盒(南京建成)测定。

1.2.4 光合色素测定

藻胆蛋白(Phy)含量测定参考高洪峰[11]的方法，略有改动。精确称取0.02 g 藻体3份，液氮研磨，加入2 mL PBS 缓冲液，放入冰箱冷冻(-20℃)，室温解后离心(12 000 r/min，4℃)20 min，上清即为藻胆蛋白粗提液，分别于565、615、650 nm波长下测定其OD值。计算公式为：

CRPE=0.123A565-0.068A615+0.015A650

(1)

CRPC=0.162A615-0.001A565-0.098A650

(2)

CAPC=0.171A650-0.006A565-0.004A615

(3)

式中，CRPE、CRPC、CAPC分别为R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的含量。

叶绿素a：测定参考文献[9]的方法。

公式：Ca=13.95OD665-6.88OD649，Ca—叶绿素a的质量浓度，mg/L。

1.2.5 可溶性蛋白测定

可溶性蛋白含量测定参考文献[12]的方法，以牛血清白蛋白为标准样测定，略有改动。精确称0.1 g鲜藻，加入1 mL缓冲液，冰上机械匀浆，4000 r/min，离心10 min (4℃)，上清即为待测蛋白溶液。

公式：样品蛋白质质量分数[μg/g(FW)]=(C×V)/W，C—查标准曲线所得样品测定管中蛋白质的浓度(μg/mL)，V—样品提取液的总体积，W—样品鲜重。

1.2.6 游离脯氨酸含量的测定

游离脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮方法测定，参考文献[13]的方法，略有改动。取新鲜藻体吸干表面水分，称0.1 g，液氮研磨，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，沸水浴10 min，5000 r/min，离心10 min，取上清液用于脯氨酸测定。

1.2.7 丙二醛(MDA)含量的测定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。0.1 g鲜藻，加入5 mL PBS磨成匀浆液，转移至10 mL试管中，加入5 mL含有0.5%硫代巴比妥酸的10%三氯乙酸，混合液在沸水中加热10 min，冷去后离心，10 000 r/min，20℃，离心10 min，收集上清，分别测定450、532和600 nm测定吸光值。

公式：MDA [μmoL/g(FW)]=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]×Vt/(1000×FW)，Vt—上清体积，FW—样品鲜重。

1.2.8 统计分析

各实验重复3次，数据采用Excel 2003、Spass 13.0统计软件进行数据处理及统计分析，P<0.05 表示显著性差异，P<0.01表示极显著性差异。

2结果与分析

坛紫菜培养至第3天，Ph-C组的坛紫菜叶片细胞的色素体层和线粒体等结构受到了一定程度的损坏，在细胞内形成了一些空泡(图1-a)，说明在无菌培养的条件下，坛紫菜生长状态受到了影响。在Ph-B组，细菌聚集在紫菜边缘，且坛紫菜色素体层和线粒体的结构完整，无明显空泡的出现，藻体细胞内线粒体数量较多(图1-b)，细胞代谢旺盛，处于良好的生长状态。

如图2-a所示，随着培养时间延长，Ph-B组和Ph-C组的POD活性呈先下降后上升的循环趋势，两组坛紫菜POD活性在12 h和48 h达到最高，分别为18.16 U/mg和17.38 U/mg。纯培养组POD活性在6 h达到最低为9.33 U/mg，共养组POD活性则在72 h达到最低为10.13 U/mg。两组坛紫菜叶状体POD活性在72 h之内无显著性差异(P>0.05)。如图2-b所示，共养组SOD活性呈逐渐下降的趋势，对照组则呈下降后又上升，其后逐渐下降的走势，共养组和对照组在6 h有显著性差异(P<0.05)，其余时间点两组没有显著性差异(P>0.05)。

图1 坛紫菜的细胞亚显微结构(a：Ph-C; b：Ph-B)

图2 芽孢杆菌对坛紫菜酶活力的影响

a：POD; b：SOD

图3-a 表示Ph-B组和Ph-C组Chla含量总体高于培养前期。Ph-B组在12 h含量最高为14.85 mg/L，Ph-C组在72 h含量最高为11.96 μg /L，Ph-B组在48 h显著高于Ph-C组(P< 0.05)。藻胆蛋白是坛紫菜的主要光合色素，其品质的好坏取决于藻胆蛋白含量的高低[14]，图3-b、c、d表示在6、12、24、48和72 h中，坛紫菜叶状体在加入附生菌后(Ph-B)，其含量均显著高于Ph-C(P<0.05)，且48 h各藻胆蛋白RPE为6.46 mg/g、RPC 3.6 mg/g和APC 2.28 mg/g含量均达到最高，而Ph-C组藻胆蛋白最高含量RPE 3.59 mg/g、RPC 1.99 mg/g和APC 1.15 mg/g。Ph-B组的藻胆蛋白含量均高于培养前(0 h)，在6 h和12 h的Ph-C组RPE含量均低于0 h的含量，12 h时RPC和APC低于起始时间的含量，总体Ph-C组呈现下降又上升的趋势。

图3 芽孢杆菌对坛紫菜色素的影响

a：Chla；b：RPC；c：APC；d：RPE

总蛋白含量是评价紫菜营养价值的重要指标[14]。由图4可知，Ph-B组和Ph-C组坛紫菜叶状体总蛋白含量大体呈上升趋势，在有附生菌存在的情况下，总蛋白含量在12、48和72 h均显著高于Ph-C组(P<0.05)，Ph-B组含量高达36 mg/g，Ph-C组则为28 mg/g。

图4 芽孢杆菌对坛紫菜总蛋白的影响

正常生长条件下植物体内的脯氨酸含量很低， 但当其处于逆境胁迫时含量可迅速增加, 通常情况下脯氨酸累积含量与植物的抗逆性呈正比关系[15]。藻体没有附生菌时，在6 h、12 h、48 h和72 h时，Ph-C组游离脯氨酸含量显著高于Ph-B组(P<0.05)，两组脯氨酸含量均在12 h分别达到最大为81.41.26 μg/g和100.93 μg/g，但培养24 h时，两组并无显著性差异(P> 0.05)。随着培养时间的增加，两组脯氨酸含量均高于培养前(图5)。

图5 芽孢杆菌对坛紫菜游离脯氨酸的影响

MDA是膜脂过氧化作用的产物，其含量可以衡量细胞膜脂损伤程度[15]。在适温(20℃)条件下，Ph-B组和Ph-C组MDA含量发生了极显著变化(P<0.01，图6)，且Ph-B组在不同时间(12、24和72 h)水平下MDA含量均极显著高于Ph-C组(P<0.01)，Ph-C组MDA含量在6和48 h时极显著高于Ph-B组(P< 0.01)，其值高达209.53 nmoL/g。

图6 芽孢杆菌对坛紫菜丙二醛的影响

3 讨论

在适宜温度下，海洋芽孢杆菌Bacillus有利于坛紫菜的生长，促进了藻体内总蛋白的积累，与坛紫菜形成互利共生的关系。植物体内SOD和POD活性的提高能增强植物对多种氧化胁迫的抗性。在本研究中，在20℃培养条件下，Ph-B和Ph-C的SOD和POD并无显著性差异(P>0.05)。这说明在适宜温度下，坛紫菜叶状体与细菌共培养并未对坛紫菜造成胁迫。作为衡量细胞膜脂损伤程度重要指标的MDA含量在Ph-C中48 h出现极显著增加现象(P<0.01)，且其含量209.53 μmol/g极高，远高于张元在21℃测量的耐高温型与野生型坛紫菜MDA含量20～30 μmol/g[13]，因此无菌处理对紫菜细胞造成了一定的影响。同时，非酶促系统如脯氨酸等的含量在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。在本研究中，紫菜叶状体在与共附生菌共同培养条件下(Ph-B)，脯氨酸含量显著低于Ph-C的坛紫菜(P<0.05)，符合坛紫菜代谢组测定的结果。在复杂的藻际微环境中，没有了生物膜这层保护系统[16]，藻细胞内脯氨酸含量随即显著上升，而到了培养后期，随着细胞内SOD含量的下降，脯氨酸含量也开始显著下降(图5)，说明脯氨酸在坛紫菜清除自由基以避免细胞损伤中也发挥了重要作用。

20℃下菌藻共培养，促进了紫菜生长，增加了光合色素的含量。藻胆蛋白和叶绿素Chl a是坛紫菜主要的光合色素。其中，藻胆蛋白被认为是藻类细胞中的主要氮源贮藏库，在适宜的光照和温度培养条件下，丰富的氮源有利于藻胆蛋白的合成，相反，在缺乏氮源的情况下，藻胆蛋白的合成明显降低甚至停止[14]。有研究证实浮游生物硅藻Pseudonitzschiamultiseries优先利用的N源是来自细菌Sulfitobacter(SA11)衍生的铵而不是外援添加的硝酸盐[17]。本课题组前期结果发现：浓度为1.0×10-8～1.0×10-6mg/mL的附生真菌Cladosporiumsp.提取物N5能促进坛紫菜叶状体和丝状体的生长以及藻胆蛋白的积累[9]。我们前期试验表明芽孢杆菌WPySW2对坛紫菜叶状体起到类似植物生长激素的作用，促进其生长，与在本实验结果一致。微藻中也报道过类似结果，微藻利用细菌产生的吲哚-3-乙酸、维生素B12来促进自身生物量的增加[18]。细菌Bacillussp. WPySW2 是通过产生类似生长调节物质还是通过为共养组坛紫菜提供氮源而促进了坛紫菜的生长，有待进一步探究。

相同温度下，我们用核磁研究了芽孢杆菌胞内代谢物，发现丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、核糖5-磷酸、尿嘧啶，还有乙酰胺、琥珀酸、甜菜碱含量显著升高(未发表)。有研究表明，玫瑰杆菌对DOM、硫化物、脲、胺、牛磺酸、甜菜碱和磷酸酯等化合物的利用，是为了与藻细胞维持的共生关系[3]。或许，芽孢杆菌在维持稳定的藻际环境中，有类似玫瑰杆菌的生态功能。但是，芽孢杆菌到底是通过哪种或哪类代谢物影响了坛紫菜的生理特征，二者之间如何进行信号物质的传递，有待深入研究。

坛紫菜的养殖和病害防治已经成为如今的一项热门研究，芽孢杆菌作为坛紫菜的藻际附生菌，通过研究芽孢杆菌对坛紫菜生长、光合作用的影响，分析其中的规律，可以很好地指导在养殖业中利用芽孢杆菌进行坛紫菜的健康养殖。在适宜温度下芽孢杆菌对坛紫菜的生理特性影响的研究中，由此得出结论：在适宜温度(20℃)下，芽孢杆菌能促进坛紫菜的生长和光合作用，附生菌能为藻体提供生长所必需的营养物质，为稳定的藻际环境提供必要条件。但是，不同环境下的藻际细菌的生态功能，有待进一步研究。

[1]BELL W, MITCHELL R. Chemotactic and growth responses of marine bacteria to algal extracellular products [J]. The Biological Bulletin,1972,143(2):265-277.

[2]崔龙波, 吴 雪, 王 琛, 等. 水环境中微藻与细菌相互关系研究进展[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(26):249-252.

[3]周 进, 林光辉, 蔡中华. 微生物在藻际环境中的物质循环作用[J]. 应用生态学报, 2016, 27(8):2708-2716.

[4]SUTHERLAND J E, LINDSTROM S C, NELSON W A, et al. A new look at an ancient order: generic revision of the Bangiales (Rhodophyta) [J]. Journal of Phycology, 2011, 47(5):1131-1151.

[5]王洪斌, 李信书, 夏亚明, 等. 条斑紫菜丝状体黄斑病病原体分离鉴定及生物学特性研究[J].海洋环境科学, 2011, 30(3):361-364.

[6]闫 咏, 马家海, 许 璞, 等. 1株引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌[J].中国水产科学,2002, 9(4): 353-358.

[7]严兴洪, 黄林彬, 周 晓, 等. 坛紫菜叶状体的细菌性红烂病研究[J]. 中国水产科学, 2008, 15(2):313-322.

[8]盖珊珊, 张伟东. 基于第二代测序技术的条斑紫菜(Pyropiayezoensis)贝壳丝状体附生菌群研究[J]. 海洋与湖沼, 2016, 47(5):990-996.

[9]吴小凯, 朱竹君, 杨 锐, 等. 紫菜共附生真菌次生代谢产物对坛紫菜生长的影响[J]. 海洋学研究，2011, 29(2): 89-99.

[10]周金梅, 杨 锐, 方文雅, 等. 坛紫菜叶状体的无菌化培养及其应用[J]. 生物学杂志, 2012, 29(3):83-87.

[11]高洪峰. 不同生长期坛紫菜中藻胆蛋白的含量变化 [J]. 海洋与湖沼, 1993, 24(6):645-648.

[12]BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.

[13]张 元. 坛紫菜对高温胁迫应答机制的初步研究 [D]. 厦门: 集美大学, 2011.

[14]马圣媛, 王广策, 孙海宝. 藻胆蛋白的研究概况Ⅲ．蓝藻藻胆蛋白合成的分子机制及调控[J]. 海洋科学, 2002, 26(8) : 40-43.

[15]周巍巍, 谢潮添, 陈昌生, 等. 低氮、磷胁迫对坛紫菜叶状体生理生化特征的影响[J]. 水产学报, 2011, 35(4):543-550

[16]WAHL M, GOECKE F, LABES A, et al. The second skin: ecological role of epibiotic biofilms on marine organisms [J]. Front Microbiol, 3:292.

[17]AMIN S A, HMELO L R, VAN TOL H M, et al. Interaction and signalling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria [J]. Nature, 2015, 522(7554):98-101.

[18]FUENTES J L, GARBAYO I, CUARESMA M, et al. Impact of microalgae-bacteria interactions on the production of algal biomass and associated compounds [J]. Mar Drugs, 2016, 14(5):100.