鲷鱼鳞多肽的酶法制备及抗氧化活性研究

方 菲,颜阿娜,汪少芸

(福州大学生物科学与工程学院, 福建 福州 350116)

0 引言

鱼鳞是鱼皮真皮层的变形物,约占鱼体质量的l%～5%[1]. 其富含的胶原蛋白,可通过酶解、 微生物发酵水解等方法来制备具有抗氧化、 降血压等生理活性的水解产物,这不仅能够充分利用资源,提高鱼类加工的附加值,还可减少环境污染,促进鱼类加工业的发展. 国内外对各种鱼类鱼肉酶解制备功能产物的研究较多,关于鱼鳞酶解制备功能产物的研究主要集中在鲢鱼[2]、 青鱼[3]、 罗非鱼[4-7]、 草鱼[8-9]、 鲤鱼[10]等鱼鳞胶原蛋白/明胶的提取,以及鱼鳞胶原蛋白/明胶生物活性肽的制备,而鲷鱼鳞的研究则未见报道.

人体很多疾病与活性氧的形成有关,抗氧化剂可通过提供氢原子或电子来阻止不饱和脂质氧化,或通过清除单线态氧来终止自由基介质导的链式反应及通过金属催化剂的失活或去除引发剂自由基中间体[11]. 本研究以鲷鱼鳞为原材料,通过物理方式进行预处理后进行酶解,制备具抗氧化活性的酶解产物,避免了酸碱脱钙处理的化学污染,为提高鲷鱼加工废弃物的利用价值和经济价值寻找新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲷鱼鳞,莆田汇丰食品有限公司提供； 酸性蛋白酶、 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶,购自诺维信(中国)生物技术有限公司； 复合风味蛋白酶,购自广州市华琪生物技术有限公司； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),购自美国sigma 公司； 其余试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司.

1.2 主要仪器与设备

XZ-21K-高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)； KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； 立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)； FE20 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)； Big Squid磁力搅拌器(德国IKA公司)； TH2-82恒温水浴摇床(金坛市鸿科仪器厂)； 自动点位滴定仪(上海精密科学仪器有限公司)； EU2600紫外可见分光光度计(上海昂拉仪器有限公司)； FD-1C-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)； Waters TM650E高效液相色谱仪(美国Waters公司)； L-8900全自动氨基酸分析仪(日本Hitachi公司).

1.3 方法

1) 样品预处理. 鱼鳞由羟基磷灰石和胶原蛋白交联组成,结构致密,直接酶解效率低. 因此,先使用粉碎机,将鱼鳞粉碎(5 min),然后结合超声[12]及高压提取[13]对鱼鳞进行处理,设置超声功率200 W,温度50 ℃,处理90 min后,121 ℃高压处理60 min.

2) 鲷鱼鳞酶解产物制备工艺. 鲷鱼鳞经预处理→调pH值→加酶酶解→灭酶→离心取上清→冷冻干燥→样品.

3) 单因素实验. 分别考察液料比、 pH值、 温度、 酶底比、 酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响.

4) 水解度测定. 采用甲醛滴定法[14].

表1 响应面优化实验因素与水平Tab.1 Variables and their levels used in the response surface design

5) 响应面优化实验. 根据Box-Behnken Design(BBD)原理,在单因素实验的基础上,选取液料比、 酶底比和pH值3个因素,试验因素及水平如表1所示,以水解度和DPPH自由基清除率为考察目标进行响应面试验设计.

6) 抗氧化活性测定. DPPH自由基清除率的测定,参照Wu等[15]的方法进行； 羟基自由基清除活性,采用Zhang等[16]的方法进行测定； 还原力的测定,参照GÜLCIN等[17]方法进行； 金属螯合率的测定,采用Dinis等[18]的方法进行.

7) 相对分子质量分布测定. 采用高效液相色谱法进行相对分子质量的测定, 条件为： Waters TM650E高效液相色谱仪(配2487 UV检测器和M32 工作站)； 色谱柱： TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)； 流动相： 乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(体积比)； 检测波长： 220 nm； 流速： 0.5 mL·min-1； 柱温： 30 ℃.

8) 氨基酸组成分析. 参照《食品中氨基酸的测定(GB/T 5009.124-2003)》[19]进行.

1.4 数据处理

使用Office 2007、 Design-Expert 8.0.6、 SPSS Statistics等软件处理数据,结果为3次平行实验的平均值.

2 结果与讨论

2.1 酶的筛选

图1 不同蛋白酶酶解后的水解度及DPPH自由基清除率Fig.1 Effect of different enzymes on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

在各个蛋白酶所推荐的最适温度和pH值条件下,按E/S 4.0%,液料比50∶1,酶解6 h,所得结果如图1所示. 由图1可知,经5种不同蛋白酶酶解后,酶解液的DPPH自由基清除率依次为： 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 酸性蛋白酶、 中性蛋白酶、 复合风味蛋白酶,水解度由大到小依次为： 复合风味蛋白酶、 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、 酸性蛋白酶. 这是由于不同蛋白酶对鱼鳞蛋白的酶切位点不同,使得酶解产物暴露出的氨基酸片段种类及数量有所不同,进而导致酶解产物的抗氧化活性有所差别[20]. 综合考虑,选用碱性蛋白酶作为鲷鱼鳞蛋白酶促水解的酶切工具.

2.2 不同条件对水解度和DPPH自由基清除率的影响

2.2.1 液料比对水解度和DPPH自由基清除率的影响

使用碱性蛋白酶在温度50 ℃,pH值8.0,E/S 7.0%的条件下,酶解6 h,比较不同的液料比对水解度和DPPH自由基清除率的影响,所得结果如图2所示. 体系的分散度受液料比的影响,由图2可知,在液料比为10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1的条件下,经酶解后所得酶解液的水解度和DPPH自由基清除率总体呈先上升后下降的趋势,在液料比为30∶1时,所得酶解液的水解度和DPPH自由基清除率均达到最大,表明在此条件下,酶与鱼鳞蛋白接触较充分,有利于酶促反应进行. 因此,将后续酶解工艺优化所用液料比确定为30∶1.

2.2.2 pH值对水解度和DPPH自由基清除率的影响

在液料比为30∶1的条件下,保持其他条件相同,探究不同pH值对水解度和DPPH自由基清除率的影响,所得结果如图3所示. 由图3可知,pH值在6.5～9.0的间隔范围内,DPPH自由基清除率与水解度为最大时所对应的pH值并不相同. 在 pH值为7.5时,酶解液的水解度达到最大,可能是该条件下酶的构像与鱼鳞蛋白能有效的契合,促进反应的进行,而DPPH自由基清除率则在pH值为 7.0时出现最大值,可能是在pH值为7.0时,酶解产物所带电荷对能促进DPPH自由基的清除. 但在实验过程中,发现体系初始pH值接近7.5,因而,将pH值设定为7.5.

图2 液料比对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of liquid to material ratio on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

图3 pH值对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of pH value on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

2.2.3 温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响

在液料比为30∶1,pH值为7.5的条件下,保持其他条件相同,探究不同的温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响,所得结果如图4所示. 温度升高,反应速率会加快,但随着温度升高,酶变性失活,导致酶促反应速率下降,酶对鱼鳞蛋白酶解所表现的最适温度是这两种影响的综合结果. 由图4可知,在酶解温度为50 ℃时,所得酶解液的水解度最大,且在该温度下,酶解液所对应的DPPH自由基清除率也达到最大值,表明酶对鲷鱼鳞蛋白酶促水解的最适温度为50 ℃,且此时活性最大. 因此,将后续酶解的温度设定为50 ℃.

2.2.4 酶底比对水解度和DPPH自由基清除率的影响

在液料比为30∶1,pH值为7.5,50 ℃的条件下,考察不同的E/S对水解度和DPPH自由基清除率的影响,所得结果如图5所示. 酶用量影响酶解效率,用量的增加一般会使效率提高. 由图5可知,在E/S为1.0%～7.0%间隔区间范围内,随着E/S的增加,水解度及DPPH自由基清除率明显增加. 在E/S为7.0%时,继续增大加酶量,酶解物的水解度和DPPH自由基清除率增加缓慢且逐渐趋近于平缓. 考虑酶促水解的效果及经济效益,选用E/S为7.0%较为适宜.

图4 酶解温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of temperature on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

图5 酶底比对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of E/S ratio on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

2.2.5 酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响

图6 酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

在液料比为30∶1,pH值为7.5,50 ℃,E/S7.0%条件下,考察酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响,所得结果如图6所示. 由图6可知,随着酶促水解时间的延长,水解度的变化呈上升趋势,在10 h后趋近平缓. 但在6～10 h范围内,DPPH自由基清除活性并没有大幅度提升,而10 h后DPPH自由基清除率表现出下降的趋势,这可能是水解度增大,组成酶解液中多肽片段的氨基酸协同作用不利于DPPH自由基的清除,从而表现出DPPH自由基清除率的降低. 考虑仪器设备的使用状况,把酶解反应时间设定为6 h.

2.3 响应面分析

2.3.1 模型的建立及显著性检验

以DPPH自由基清除率和水解度为响应值,采用Box-Behnken实验原理设计3因素3水平的响应面实验,所得结果如表2所示. 对试验数据进行回归模型的方差分析,所得DPPH自由基清除率和水解度的回归模型方差分析如表3、 4所示.

表2 响应面优化实验设计及结果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

续表2 Continue table 2

表3 DPPH自由基清除率回归模型的方差分析Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model of DPPH free radical scavenging rate

注：P<0.001 表示极显著***；P<0.01表示较显著**；P<0.05 表示显著*；P>0.05 表示不显著

表4 水解度回归模型方差分析Tab.4 ANOVA for response surface quadratic model of DH

注：P<0.001 表示极显著***；P<0.01表示较显著**；P<0.05 表示显著*；P>0.05 表示不显著

由软件分析得DPPH自由基清除率与各因素的回归方程为： DPPH自由基清除率(%)= 81.03-1.79A+6.84B+0.83C-0.16AB+1.42AC-0.66BC-4.35A2-1.66B2+1.17C2,由表3可知,一次项A、B,二次项A2、B2对DPPH自由基清除率的影响显著,交互项对DPPH自由基清除率的影响不显著,且该方程相关系数R2=0.978 6,表明仅有2.14%响应值变化不能用该模型解释,此外,P<0.000 1,即该模型显著,且失拟项不显著,因而,该方程与实际拟合较好,可用于预测酶解过程中酶解产物的DPPH自由基清除活性.

2.3.2 响应面优化和验证

综合考虑水解度和DPPH自由基清除率两个衡量指标优化酶解条件,控制水解度在10%,DPPH在81%,选取鲷鱼鳞酶解工艺优化的条件为： 液料比27.7 ∶1,E/S=6.95%,pH=7.29,为便于实际操作,将参数进一步调整为： 液料比28∶1,酶底比7.0%,pH 值7.3进行试验验证,试验重复3次取平均值,所得酶解液DPPH自由基清除率为(82.33±1.03)%,水解度为(10.35±0.12)%,与理论值接近,证明了方程的可靠性及统计学方法的有效性. 此外,未酶解液的DPPH自由基清除率为14.15%,表明经酶解后抗氧化活性有了显著性提高(P<0.001).

2.4 抗氧化活性分析

酶解液经冷冻干燥后,进行DPPH自由基、 羟基自由基清除活性、 还原力以及金属螯合率测定来表征酶解产物的体外抗氧化活性,所得结果如图7所示.

酶促水解产物的抗氧化实验表明其抗氧化活性与酶解液的质量浓度呈剂量依赖性. 如图7(a)所示,酶解产物的DPPH自由基清除率随酶解液质量浓度的上升而增强,其IC50(半数清除质量浓度)为2.33 mg·mL-1,说明酶解产物对DPPH自由基具有较强的清除能力； 图7(b)为酶解产物对羟基自由基的清除率,其IC50为4.27 mg·mL-1. 图7(c)为还原力测试,随着酶解液质量浓度的增高,还原力也不断增高,在测试范围内呈正相关,表现出一定的还原性,在酶解液质量浓度为6.0 mg·mL-1时,其吸光值为0.4. 图7(d)为酶解物的金属螯合率,随酶解液质量浓度的上升呈上升趋势,当质量浓度为6.0 mg·mL-1时,金属螯合率仅为29.49%,这可能是鱼鳞本身含有羟基磷灰石,在酶促水解过程中释放出钙离子,并与多肽片段结合,使得金属结合位点被占据,从而表现出较低的外来金属螯合率.

图7 不同质量浓度酶解物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of hydrolysate at different concentration

2.5 相对分子质量分布测定

图8为鲷鱼鳞酶解产物相对分子质量分布图,酶解产物中存在多种大小不等的肽片段,相对分子质量集中分布在5 ku以下,其中相对分子质量为180～1 000 u的占70.29%,表明酶解产物中具有较多的寡肽,这与杨立等[8]的结果相类似,而小分子肽片段可产生离子化的氨基和羧基,易于提供电子或氢原子,从而终止自由基介质导的链式反应[11],有利于酶解产物展现其抗氧化活性.

图8 酶解产物相对分子质量分布图Fig.8 Molecular weight distribution of the hydrolysate measured by HPLC

2.6 氨基酸组成分析

将制备得到的鲷鱼鳞酶解产物进行氨基酸组成测定后,所得结果如表5所示. 由表5可知,鲷鱼鳞酶解产物氨基酸组成丰富,其中甘氨酸质量百分含量最高,占所有氨基酸组成中的32.98%,其次为丙氨酸(12.85%)、 脯氨酸(10.41%),羟脯氨酸(7.14%),表明酶解产物中含有的胶原肽质量百分含量较多,而丙氨酸、 脯氨酸、 羟脯氨酸等对自由基清除具有较好的效果,因而,酶解产物表现出一定的抗氧化活性[21-22]. 此外,鲷鱼鳞酶解产物中谷氨酸、 精氨酸、 天冬氨酸、 丝氨酸的质量百分含量也较高,占氨基酸总量比分别为： 7.69%、 4.71%、 4.59%、 4.31%. 酶解物中含有除色氨酸外的7种人体所必需的氨基酸,其总质量百分含量占13.75%,可作为优质的海洋多肽源.

表5 鲷鱼鳞多肽氨基酸组成Tab.5 Amino acid composition of Snapper scales peptides (%)

3 结语

1) 经响应面优化设计后在液料比28∶1,酶底比为7.0%,pH值为7.3条件下,酶解6 h,所得酶解液的水解度为10.35%,DPPH自由基清除率为82.33%.

2) 抗氧化实验表明,酶解产物的抗氧化活性与酶解物的浓度呈剂量依赖性,其中DPPH自由基清除率的IC50为2.33 mg·mL-1,羟基自由基的清除率IC50为4.27 mg·mL-1,同时表现出一定的还原力和金属螯合率.

3) 鲷鱼鳞酶解产物中主要为寡肽,其氨基酸组成丰富,含有多种人体所必需的氨基酸.

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